创(烧)伤后皮肤缺损是临床最常见的病症之一,创面处理是此类患者救治处理的基础问题和核心问题,自体皮源的不足是大面积创(烧)伤治疗的瓶颈。随着组织工程的拓展,应用干细胞技术可望为创(烧)伤修复提供新的手段。胚胎干细胞的研究受到伦理学和细胞来源等方面的限制,因而成体干细胞的研究受到人们的高度重视。研究表明,表皮干细胞在特定条件下如皮肤缺损可进行表皮再生,然而正常皮肤内表皮干细胞数量有限,而大面积创(烧)患者表皮干细胞来源更有限。同时表皮干细胞的分离、纯化和培养技术尚不够成熟,未能满足临床运用要求。因此有必要探索一条新的途径来克服皮肤种子细胞的技术难度和瓶颈问题。近年来有学者认为,骨髓来源细胞(bone marrow-derived cells,BMDCs)也可以成为皮肤祖细胞一个重要补充源。骨髓来源细胞含有造血干细胞(haematopoietic stem cells, HSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和SP细胞(side-population cell)。有学者认为骨髓干细胞具有高度可塑性,可跨越胚层界限,向中胚层、内胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化。体外诱导研究证实其可以分化为成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肝细胞、神经细胞等多种组织细胞,同时骨髓干细胞移植在多种疾病的治疗中均显示了临床疗效。然而,成体组织干细胞是否可分化成为在发育上无关的其它系列的细胞类型,亦即成体组织干细胞是否具有“可塑性”抑或“横向分化”潜能,近年来众多科学家开始质疑。有学者认为,骨髓细胞在体内不能横向分化为神经细胞。同时,有学者发现骨髓来源干细很少参与叶酸致伤的肾脏损伤修复。成体组织干细胞在体是否具有“横向分化”的潜能引起广泛质疑。骨髓来源细胞能否跨胚层分化为表皮细胞参与皮肤修复目前也存在争议。骨髓来源细胞在皮肤组织修复中的作用目前还远不明确。足够数量的干细胞和组织损伤的微环境是骨髓干细胞横向分化促进组织修复的两个关键条件。在稳定的造血状态下,骨髓干细胞的数量很少,约占骨髓细胞总数的十分之一至百分之一,外周血干细胞的含量更低,只占其单个核细胞的0.1%-1%。而当机体在应激、损伤等情况时,外周循环中的干细胞数量可明显增多,但这种增多作用较弱,严重损伤时不能满足机体修复的需要。细胞因子生长因子在干细胞动员和迁移到损伤部位中起重要作用,为损伤修复提供了新途经。骨髓动员后,人体外周血干细胞比例将增加10-20倍,而在小鼠中甚至能达到120倍。粒细胞集落刺激因子是目前最常用的动员剂,已证实具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力。为此我们假设,骨髓来源细胞在G-CSF动员后,极可能有效地促进皮肤损伤修复。为证实我们的设想,并为临床自体骨髓来源细胞动员治疗皮肤损伤提供理论依据和技术基础,本研究建立转绿色荧光蛋白嵌合小鼠,以示踪G-CSF动员后自体骨髓来源细胞在创面修复中的作用,并初步探讨其相关机制。第一部分C57BL/6J小鼠同基因骨髓移植模型的建立和观察目的:研究C57BL/6J小鼠全骨髓毁损最适辐照剂量。研究最适致死剂量辐照后的小鼠骨髓毁损程度和后期效应。方法:观察不同剂量辐照(7.0Gy, 8.0Gy, 9.0Gy和10.0Gy)的C57BL/6J小鼠行或未行骨髓移植后的生存率差异。动态检测8.0Gy辐照小鼠辐照后体重变化。C57BL/6J小鼠8.0Gy辐照后,接受GFP转基因小鼠的骨髓移植,检测骨髓重建后外周血白细胞中GFP阳性细胞情况。动态观察小鼠辐照后毛色变化及TRP-2表达变化。结果: 7.0Gy组未行骨髓移植的辐照小鼠死亡率为40%;8.0Gy、9.0G y、10.0Gy组未行骨髓移植的辐照小鼠全部死亡。7.0Gy、8.0Gy辐照和9.0 Gy辐照的骨髓移植小鼠死亡率无显著差异(0 vs 0 vs.20 %,p> 0.05),而9.0 Gy辐照和10.0 Gy辐照的骨髓移植小鼠存活率存在显著差异(20% vs.80%, p<0.01)。致死剂量辐照后,小鼠体重急剧下降,实验组于第9天开始回升,2周左右恢复至正常水平,对照组体重持续下降至死亡。外周血白细胞中GFP阳性细胞的平均百分率为94.1±2.8%。辐照后小鼠随时间毛发色素逐渐脱失,至辐照后8个月小鼠毛色接近纯白。免疫组化显示TRP-2蛋白表达量随时间逐步降低。结论: 8.0Gy是C57BL/6J小鼠骨髓毁损的最适照射剂量。体重监测是检测骨髓功能重建的良好无创指标。小鼠毛发色素逐步脱失是辐照的远期效应,TRP-2表达降低可能是小鼠毛色脱失的可能相关因素之一。第二部分粒细胞集落刺激因子动员骨髓来源细胞促进创面修复的实验研究目的:研究粒细胞集落刺激因子动员骨髓来源细胞对皮肤缺损伤修复的作用方法:实验一建立的转GFP嵌合小鼠辐照后8周,行脾切除术,2周以后,小鼠随机分为骨髓动员组和对照组。骨髓动员组小鼠连续5天予以皮下注射重组人的粒细胞集落刺激因子50ug/kg/day,对照组小鼠给予相同剂量的生理盐水。建立小鼠背部1.3×1.3 cm2大小全层缺损伤。实验组继续给予G-CSF动员3天,对照组给予相同剂量的生理盐水。伤后每日观察各组动物创面大小、收缩程度及愈合情况,并照相记录。检测外周血白细胞计数,每3天取血一次,检测至创面愈合。分别于术后第0、3、6、9、12、15、18和21天运用活体荧光成像仪(Maestro,CRi, Woburn, MA)记录小鼠创面GFP荧光强度。取骨髓动员组小鼠创面(术后5天)或愈合皮肤(愈合后1周)组织制取冰冻切片直接荧光显微镜下观察,同时行免疫荧光双标记检测CK10、α-SMA和factorⅧ。结果:骨髓动员后外周血白细胞逐步升高,于动员后第6天达到峰值为27.87±2.34/L,随后白细胞数逐步回降,至伤后第15天已降至正常值范围。而对照组外周血白细胞均在正常值范围。G-CSF骨髓动员组小鼠创面愈合时间较对照组提前5天,两组小鼠愈合时间分别为12.5±0.9d (骨髓动员组)和18.3±0.8 d(对照组),差异有统计学意义。活体荧光成像仪检测显示,骨髓动员组小鼠创面荧光强度在创面愈合过程中各时间点均高于对照组荧光强度,差异有统计学意义。在创面愈合后一周,骨髓动员组在愈合创面处仍可检测到明显荧光信号(0.09±0.01ms),而对照组荧光信号微弱( 0.02±0.006ms),差异有统计学意义。组织形态学检查显示,骨髓动员组小鼠创面(术后5天和愈合后一周)组织切片在荧光显微镜下显示创面内有大量荧光细胞存在,分布在肉芽组织内荧光细胞,呈梭形成纤维细胞状,α- SMA表达阳性;分布在真皮层及皮下脂肪层的血管周围的荧光细胞,包绕血管或位于血管内皮处的血管内皮状,F-Ⅷ表达阳性;分布在真皮层及皮下脂肪层的新生毛囊周围的荧光细胞,多位于毛囊外根鞘,CK10表达阳性。此外,本实验观察到,在毛囊再生过程中,位于新生毛囊外根鞘细胞的荧光细胞可向毛囊周边表皮细胞迁移分化和增殖。结论:本研究结果显示:1、G-CSF骨髓动员可促进小鼠创面愈合,愈合时间提前5天;2、骨髓动员后BMDCs在创面部位的聚集可持续到创面愈合一周后,提示BMDCs不仅参与创面愈合早期的炎症反应,而且参与了创面的修复和重塑;3、BMDCs在创伤微环境的诱导下可向毛囊细胞、表皮细胞、血管内皮细胞和肌成纤维细胞等细胞分化;4、BMDCs向创面组织迁移可能以毛囊干细胞龛——毛囊外根鞘为“中转站”。第三部分粒细胞集落刺激因子骨髓动员对创面局部生长因子表达的影响目的:研究粒细胞集落刺激因子动员对VEGF、bFGF及EGF表达的影响。方法:动物分组和处理同第二部分。定期取创面组织抽提总RNA以实时荧光定量RT-PCR检测VEGF、bFGF及EGF变化情况,实验结果数据采用SPSS 11.0软件,应用重复测量的方差分析方法,对组内及组间表达差异进行分析比较。采用Spearman等级相关性分析对创面荧光强度与VEGF、bFGF及EGF的表达进行相关性检测。结果:VEGF表达:对照组术后第一天始至伤后第12天VEGF表达显著升高,峰值在第6天,至创面愈合时逐渐恢复正常。G-CSF动员后第0、3、6、9天VEGF表达较对照组明显增高,峰值在第6天,第12天VEGF表达恢复至正常范围。bFGF表达:对照组术后创面bFGF表达升高,第3天达峰值,随即下降至正常范围。G-CSF动员组第3、6天bFGF表达持续增高,随即下降至正常范围。峰值实验组和对照组没有差异,伤后第6天实验组EGF表达较对照组明显增高。EGF表达:对照组术后创面EGF表达升高,第3天达峰值,随即下降至正常范围。G-CSF动员组第3、6天EGF表达持续增高,随即下降至正常范围。峰值实验组和对照组没有差异,伤后第6天实验组EGF表达较对照组明显增高(P<0.05)。Spearman等级相关性分析结果表明,创面荧光强度与VEGF、bFGF和EGF的表达水平均有相关关系(P<0.01)结论:G-CSF可以提高皮肤缺损创面VEGF的表达以及延长EGF和bFGF高表达时间,同时创面荧光强度与VEGF、bFGF和EGF的表达量有相关关系。由此推测G-CSF骨髓动员可以刺激巨噬细胞、内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞等骨髓来源细胞在创面大量聚集并分泌VEGF、bFGF和EGF等生长因子,是G-CSF促进创面愈合的可能途径之一。