第一章Fascin、E-cadherin、Vimentin在胆管癌组织中的表达及相关性研究目的探讨Fascin、E-cadherin、Vimentin在胆管癌组织中的表达,临床意义及三者之间的相关性方法应用免疫组化SABC法检测142例胆管癌及20例良性胆管组织中Fascin、E-cadherin、Vimentin表达情况。结果1.胆管癌Fascin阳性率显著高于对照组(P<0.01)。胆管癌E-cadherin胞膜缺失率显著高于对照组(P<0.01),胆管癌中Vimentin膜阳性表达率显著高于对照组(P<0.01),差异均有统计学意义；2. Fascin与胆管癌组织分化程度、门静脉侵润、淋巴结转移、脏器转移、术后生存率等因素有关(P<0.05)；E-cadherin蛋白缺失与患者肿瘤分化程度有关(P<0.05)；Vimentin表达与分化程度、门静脉侵犯、肝炎病毒携带以及术后生存率相关(P<0.05)；3.胆管癌中Fascin表达与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.464,P<0.01), Fascin表达与Vimentin表达呈正相关(r=0.313,P<0.01),E-cadherin膜表达与Vimentin膜表达呈负相关(r=-0.241,P<0.01)。结论1.在胆管癌组织中Fascin呈阳性表达,E-cadherin呈现膜缺失,Vimentin呈阳性表达,提示与肿瘤的侵袭和转移有关,三者联合应用是预测胆管癌预后的有价值的分子生物学指标；2.胆管癌的中发生了上皮间叶表型样转化(epithelialto-mesenhymal transition, EMT),并与其侵袭转移密切相关；3.胆管癌中,fascin表达上调可能诱导了EMT现象,从而促进胆管癌侵袭转移。第二章Fascin基因干扰慢病毒载体构建、包装及稳定转染胆管癌细胞系的建立目的运用RNA干扰技术建立fascin低表达的胆管癌细胞系方法1.实时定量PCR(RT-PCR)检测胆管癌细胞系(RBE, QBC939)中fascin表达量,根据结果选择最合适本实验细胞；2.设计合成4条fascin-siRNA靶序列,同时设计1条阴性对照序列,构建重组shRNA穿梭质粒,经阳性克隆测序结果分析鉴定后,将它们分别与包装质粒混合物共感染293T细胞,荧光法测定感染效率；3.选择感染效率最高1组慢病毒颗粒感染给胆管癌细胞；4.应用RT-PCR及western bolt检测各组细胞中fascin的表达水平。结果1. RT-PCR检测发现QBC939中fascin基因mRNA的相对含量较高,选择QBC939进行后续试验2.测序结果显示,4组慢病毒颗粒均通过检测,重组成功；3.荧光法测定发现QBC939细胞的感染效率均达到80%以上；4. RT-PCR及western blot检测发现,加RNAi靶点病毒感染的细胞组fascin基因的表达明显下降,其中KD2组效果最佳,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.本研究通过慢病毒载体构建及包装,内源性靶筛,病毒感染胆管癌细胞QBC939,成功构建了稳定fascin低表达胆管癌细胞,为进一步研究fascin在胆管癌中的作用奠定了基础；2.胆管癌细胞中,运用RNA干扰技术能沉默fascin基因。第三章RNA干扰沉默fascin表达对胆管癌细胞生物学行为的影响目的在胆管癌细胞中RNA干扰沉默fascin表达后,检测胆管癌细胞增殖及侵袭力的变化方法1.MTT检测RNA干扰沉默fascin表达前后增殖能力变化；2. Transwell实验检测RNA干扰沉默fascin表达前后侵袭力变化；3.细胞划痕实验检测RNA干扰沉默fascin表达前后转移能力变化。结果1.MTT检测发现RNA干扰沉默fascin表达后细胞生长的速度明显降低,差异有统计学意义(p<0.05))；2. Transwell实验检测RNA干扰沉默fascin表达后转移率显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)；3.划痕实验可见RNA干扰沉默fascin表达后细胞迁移速率明显下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939增殖能力下降；2.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939侵袭能力下降；3.RNA干扰沉默fascin基因的表达使胆管癌细胞QBC939迁移能力下降。第四章Fascin基因对胆管癌EMT的作用及相关信号通路的探讨目的探讨fascin在胆管癌中是否诱导EMT及相关信号转导通路方法1. western blot检测E-cadherin、vimentin表达变化,判断fascin是否诱导EMT。2.运用免疫荧光分析P-catenin (Wnt通路调节物)在肿瘤细胞中的分布变化,western blot检测β-catenin在细胞核,细胞浆及细胞膜蛋白量的变化,同时western blot检测下游靶基因MMP7,cyclin D1表达变化,判断fascin是否作用于Wnt信号通路。结果1. western blot检测发现,RNA干扰fascin表达组中E-cad的表达明显高于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；2. western blot检测发现,RNA干扰fascin表达组中vimentin的表达明显低于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；3.免疫荧光分析发现P-catenin在细胞核的分布明显减少,而在胞浆及包膜中分布增加,同时western blot检测发现P-catenin在细胞核的蛋白量也减少,胞浆及包膜的蛋白量稍有增加,但总蛋白量无明显变化；4. Western blot检测发现,RNA干扰fascin低表达组中MMP7、 cyclin D1的表达均明显低于非特异性对照组及对照组,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.在胆管癌中的沉默Fascin基因表达导致E-cadherin表达上调、vimentin表达下降,提示fascin可诱导胆管癌细胞发生上皮-间叶样表型转化；2.在胆管癌中的沉默Fascin基因表达导致P-catenin在胞核及胞浆内的表达减少、在包膜的表达增加,而沉默fascin表达后E-cadherin的表达上调,提示fascin与P-catenin可能在包膜上竞争性与E-cadherin结合；3.在胆管癌中沉默fascin基因表达后,Wnt/β-catenin信号通路下游指标MMP7及Cyclin D1表达下降、β-catenin在胞核中分布减少,提示Wnt/β-catenin信号通路是fascin诱导胆管癌EMT发生的重要信号通路。第五章Fascin基因对胆管癌裸鼠移植瘤增殖能力的影响目的建立胆管癌裸鼠移植瘤模型,观察fascin在体内对胆管癌增殖的影响方法1.采用皮下注射法建立胆管癌裸鼠移植瘤模型；2.分别使用fascin基因的干扰慢病毒(实验组)和阴性对照组病毒(非特异性对照组)、PBS(对照组)进行瘤体局部注射给药,观察移植瘤生长情况。3. Western blot检测三组中fascin, vimentin, E-cadherin的表达情况结果1.本实验成功建立裸鼠体内胆管癌皮下移植瘤模型；2.实验组肿瘤体积明显小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；3. western blot检测发现,实验组中E-cad的表达明显高于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；4. western blot检测发现,实验组中vimentin的表达明显低于非特异性对照组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；结论1.在体内试验中,fascin基因的干扰慢病毒能有效抑制胆管癌细胞QBC939移植瘤的生长；2.在体内实验中进一步证实fascin基因能诱导EMT发生。