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研究背景双酚A(bisphenol A,BPA)是世界范围内大量生产使用的工业原料,是合成环氧树脂和聚碳酸酯塑料的结构基础,长期以来被广泛应用于食品饮料包装、牙科密封剂等与人类日常生活密切相关的塑料制品生产。人类可经消化道、呼吸和皮肤接触等途径摄入BPA。人群调查显示90%的人群暴露于BPA。作为一类公认的环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs),环境低剂量BPA暴露可对机体产生多系统毒作用,尤其是生命早期的暴露会对出生后免疫系统产生长久的影响。研究表明配体激活转录因子芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)不仅介导多种环境污染物的毒作用,而且以配体依赖的方式调节Th0细胞向Treg或Th17细胞分化,影响Treg/Th17细胞和功能的平衡。然而围生期BPA暴露对子代出生后Ahr表达及其对Treg/Th17细胞平衡的影响目前还不清楚。目的通过分析饮水摄入不同剂量BPA母鼠所生仔鼠断乳时Treg和Th17细胞比值、相应的特征性转录因子叉状头蛋白3(forkhead box protein 3,Foxp3)和维甲酸相关孤核受体γt(retinoic acid related orphan receptorγt,Rorγt)m RNA表达水平的比值、相对应的细胞因子白介素(interleukin,IL)-10和IL-17水平的比值,以及Ahr m RNA表达水平的差异,并分析它们之间的相关关系。探讨围生期BPA暴露对子代Ahr表达和Treg/Th17细胞平衡的影响及相关关系,为阐明BPA发育免疫毒作用机制提供基础资料。方法选取健康状况良好的8周龄ICR雌鼠和9周龄ICR雄鼠饲养于清洁级动物房,适应性饲养一周后交配,查阴栓确认受孕。受孕母鼠随机分为空白对照组、溶剂对照组、10、100和1 000 nmol/L BPA剂量组,母鼠自妊娠第0天(gestation day 0,GD 0)至仔鼠断乳(出生后第21天,postnatal day 21,PND 21)经饮水摄入BPA。PND 21时处死仔鼠,去眼球取血,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测血清中Treg细胞分泌的IL-10和Th17细胞分泌的IL-17的含量;取脾脏,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测CD4+IL17+Th17和CD4+CD25+Treg的细胞数量,实时荧光定量聚合酶链反应(real timequantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)检测Treg和Th17特异性转录因子Foxp3、Rorγt和Ahr m RNA的表达水平,蛋白质印迹技术(Western blotting)测定Ah R蛋白水平。实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行录入和分析。结果1一般情况:实验期间各时间段各组母鼠和仔鼠一般状况良好,未出现小鼠死亡和流产等现象。各组孕鼠体重增长差异无统计学意义;平均窝仔数没有统计学差异;PND 21时各组仔鼠体重无统计学差异。2母鼠饮水摄入BPA对仔鼠脾脏Treg和Th17细胞的影响PND 21时,母鼠围生期BPA暴露导致子代脾脏Treg细胞数量随暴露剂量的增加而下降,而Th17细胞数量随暴露剂量的增加而升高。仔鼠脾脏Treg/Th17比值随母鼠BPA暴露剂量的增加而降低;与空白对照组和溶剂对照组相比:10nmol/L BPA剂量组仔鼠脾脏Treg/Th17细胞数量比值降低(P<0.05),100和1 000nmol/L BPA组差异更明显(P<0.01)。3母鼠饮水摄入BPA对仔鼠脾脏Foxp3和Rorγt m RNA表达的影响PND 21时,母鼠围生期BPA暴露导致子代脾脏Foxp3 m RNA表达水平随暴露剂量的增加而下降,而Rorγt m RNA表达水平随暴露剂量的增加而升高。仔鼠脾脏Foxp3/Rorγt m RNA表达水平比值随暴露剂量的增加而降低。与对照组相比:10 nmol/L BPA剂量组仔鼠脾脏Foxp3/Rorγt m RNA表达水平比值降低(P<0.05),100和1 000 nmol/L BPA组差异更明显(P<0.01)。4母鼠饮水摄入BPA对仔鼠血清IL-10和IL-17的影响PND 21时,BPA剂量组仔鼠血清IL-10水平随剂量增加呈现降低趋势,但是方差分析结果显示,尚不能认为5组IL-10水平均数不全相同(P>0.05)。仔鼠血清IL-17水平随剂量增加而升高,血清IL-10/IL-17比值随剂量增加而减小。与对照组相比,10 nmol/L BPA剂量组仔鼠血清IL-10/IL-17比值减小且差异具有统计学意义(P<0.05),100和1 000 nmol/L BPA剂量组仔鼠血清IL-10/IL-17比值显著降低(P<0.01)。5母鼠饮水摄入BPA对仔鼠脾脏Ah R的影响PND 21时,BPA剂量组仔鼠脾脏Ahr m RNA表达水平和Ah R蛋白表达水平Ah R蛋白表达水平随剂量增加而升高。6相关性分析6.1脾脏Treg/Th17细胞比值与Ahr m RNA表达水平的相关性分析Treg/Th17细胞比值与Ahr m RNA表达水平呈负相关,且有统计学意义(r=-0.870,P<0.01)。6.2脾脏Foxp3/Rorγt m RNA表达水平比值与Ahr m RNA表达水平的相关性分析Foxp3/Rorγt m RNA表达水平与Ahr m RNA表达水平呈负相关性且具有统计学意义(r=-0.815,P<0.01)。6.3血清细胞因子IL-10/IL-17比值与Ahr m RNA表达水平的相关性分析IL-10/IL-17比值与Ahr m RNA表达水平呈负相关性且具有统计学意义(r=-0.774,P<0.01)。结论1围生期低剂量BPA(低于EPA的Rf D水平)暴露对孕鼠体重、平均窝仔数和断乳前仔鼠体重影响不明显;2随着暴露剂量的增加,仔鼠Treg/Th17细胞比值、Foxp3/Rorγt表达水平、IL-10/IL-17比值均降低;3随着暴露剂量的增加,仔鼠Ahr表达水平升高,且与Treg/Th17细胞比值、Foxp3/Rorγt表达水平比值和IL-10/IL-17比值之间存在负相关关系。围生期低剂量BPA暴露可能通过上调Ahr表达,促使Foxp3/RORγt细胞因子上调,最终影响仔鼠Treg/Th17细胞平衡。