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目的研究MicroRNAs（miRNAs）在结核分枝杆菌与巨噬细胞免疫应答反应中的调控作用，并探讨其可能的作用机制。方法1.建立BCG刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞模型，分别在4h、8h、12h、24h提取细胞small RNA，并利用相应的茎环反转录引物，反转录成cDNA，同时构建成熟miR-203、miR-142-3p、miR-21、miR-155、miR-132、miR-200c的T载体，绘制标准曲线，利用Real-Time PCR检测这6个miRNAs的表达量。2.根据小鼠miR-142-3p（miRBase NO:MIMAT0000155）的基因序列，化学合成含有miR-142-3p成熟序列的短发夹RNA（small hairpin RNA，shRNA），克隆入pSicoR质粒中，经双酶切及测序鉴定，阳性质粒命名为pSicoR/miR-142-3p；另外合成miR-142-3p inhibitors (23nt2’-甲氧修饰的RNA寡核酸，能有效抑制成熟miR-142-3p的表达)。利用脂质体将pSicoR/miR-142-3p和miR-142-3pinhibitors分别转染RAW264.7细胞中，利用Real-Time PCR检测miR-142-3p表达水平。3．利用miRanda、Targetscan和PicTar等靶基因预测软件对miR-142-3p作用的靶基因进行生物信息学预测。通过预测，我们选定IRAK-1为研究的靶基因，然后构建IRAK-13’UTR萤火虫荧光素酶表达载体，以海肾荧光素酶作为参照，采用双荧光素酶报告基因系统，检测过表达或沉默miR-142-3p后对荧光素酶活力的影响，以此验证miR-142-3p与IRAK-1之间的关系。同时利用Western blot检测IRAK-1蛋白质表达水平。4.将重组载体pSicoR/miR-142-3p和miR-142-3p inhibitors分别转染RAW264.7细胞24h后，然后利用BCG刺激RAW264.7细胞12h后收集细胞，提取总RNA，检测靶基因IRAK-1以及下游转录因子NF-κB，细胞因子TNF-α、IL-6mRNA的表达水平。结果1. BCG感染RAW264.7巨噬细胞4h、8h、12h、24h后，Real-Time PCR检测结果显示：miR-155、miR-132、miR-200c、miR-142-3p表达显著下调（p＜0.05），miR-21表达显著上调（p＜0.05）。而miR-203在4h、8h、12h后表达显著下调，24h后表达略有升高，但差异不显著，结果说明这些差异表达的miRNAs可能调控BCG引起的巨噬细胞免疫应答反应。2.转染重组载体pSicoR/miR-142-3p后miR-142-3p表达上调21倍（p＜0.05），转染miR-142-3p inhibitors后miR-142-3p表达降低了3/4（p＜0.05）。结果表明重组载体pSicoR/miR-142-3p可以在巨噬细胞内过表达成熟的miR-142-3p，从而显著上调miR-142-3p表达水平；miR-142-3p inhibitors可以抑制巨噬细胞内miR-142-3p的表达，从而显著下调miR-142-3p表达水平。3.通过双荧光素酶报告基因系统证实了miR-142-3p可以靶向结合IRAK-13’UTR的保守位点抑制其表达；IRAK-1mRNA Real-Time PCR结果显示：转染pSicoR/miR-142-3p和miR-142-3p inhibitors对IRAK-1mRNA的表达没有影响；Western blot分析结果显示：过表达miR-142-3p后IRAK-1蛋白质表达降低了5/6（p＜0.05），抑制miR-142-3p表达后IRAK-1蛋白质表达增加1.8倍。这些结果表明，miR-142-3p对于IRAK-1表达的影响是转录后水平调控的，并不影响IRAK-1mRNA的表达量而是抑制它的翻译从而影响IRAK-1蛋白质的表达。4.通过检测NF-κB、TNF-α、IL-6的表达，来观察miR-142-3p对IRAK-1的下游细胞因子的影响，评价miR-142-3p对TLRs/IL-1R通路炎性反应的调控。结果显示，转染pSicoR/miR-142-3p后RAW264.7巨噬细胞NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA表达显著性降低，而转染miR-142-3p inhibitors后RAW264.7巨噬细胞中NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA表达显著性升高。这些结果表明miR-142-3p可以通过靶向作用IRAK-1的表达，影响NF-κB及下游细胞因子的表达，在TLRs/IRAK-1/NF-κB信号通路中起到负向调控作用。结论1.BCG感染RAW264.7巨噬细胞后，miR-203、miR-155、miR-132、miR-200c、miR-142-3p表达显著下调（p＜0.05），miR-21表达显著上调（p＜0.05）。表明这些差异表达的miRNAs可能调控BCG引起的巨噬细胞免疫应答反应。2.miR-142-3p可以通过靶向调控IRAK-1的表达，直接影响TLRs/IL-1R通路下游转录因子NF-κB、TNF-α、IL-6细胞因子的表达，介导其炎性反应，负向调控BCG与RAW264.7巨噬细胞的免疫应答反应。