莱茵衣藻是一种单细胞真核藻类,它的世代时间短、有鞭毛、可以进行有性或无性繁殖,一直被用作细胞和分子生物学研究的模式生物。莱茵衣藻能进行光合作用,有“光合酵母”之称,它不仅是研究光合作用机制的模式生物,也被作为绿色细胞工厂生产重组蛋白药物。突变体库是研究模式物种最重要的资源与平台,但是目前莱茵衣藻突变体库的构建方法仍然存在不足,其中无效突变体过多和鉴定插入位点困难影响建库效率。本研究针对这两个问题,提出通过改造抗性表达盒和利用3’RACE的方法高效获取和鉴定莱茵衣藻基因突变体,具体结果如下:(1)获得莱茵衣藻基因突变体:设计并构建了缺乏3’UTR的ble基因抗性表达盒,转化莱茵衣藻后,通过含zeocin抗性的平板筛选,成功获得突变体。(2)获得突变体的基因插入信息:提取突变体的RNA进行RT-PCR,获得ble基因及其连接的序列,测序比对后证实连接的序列为莱茵衣藻基因组序列,成功预测了该突变体的基因插入位置。(3)验证突变体的基因插入位置:根据预测的基因设计引物扩增突变体的基因组,获得的目的片段明显大于野生型结果,测序进一步证实抗性表达盒插入到该基因中,与预测结果一致。(4)小规模试验证实方法的可行性,获得了20个突变体的基因插入信息:利用以上建立的实验方法,获取了20个突变体的基因插入信息。其中有17个突变体的抗性表达盒插入位置预测在注释基因内,有效突变体占比高达85%以上。根据预测信息,利用PCR鉴定抗性表达盒插入到基因编码框中的10个突变体,有8个确认了正确的插入位置,阳性率达80%以上,证实预测信息的准确性很高,该方法稳定可靠。综上所述,本研究建立了一种高效获取和鉴定莱茵衣藻功能基因突变体的方法,解决了建库过程无效突变体数量多和插入位点鉴定困难的问题,为建立大规模的莱茵衣藻突变体库提供参考和帮助。