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目的：本研究旨在应用网络药理学方法探索乌头汤治疗类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)的作用机制并通过实验进一步验证。方法：1.采用网络药理学方法对乌头汤(Wu-Tou Decoction, WTD)治疗类风湿关节炎的潜在作用机制进行分析,具体步骤如下：首先,在台湾中医药资料库(Traditional Chinese Medicine Database@ Taiwan, TCM Database@ Taiwan)检索乌头汤各组分中药含有的化学成分,在PubChem中检索与这些化学成分相互作用的靶蛋白,在GenBank数据库中检索与RA相关的基因。然后,将乌头汤靶蛋白和RA相关基因在线上传至生物信息分析软件Ingenuity Pathway Analysis (IPA),经大规模数据分析,得到乌头汤靶蛋白和RA相关基因构成的分子网络及信号通路,经比较分析得到乌头汤靶蛋白和RA相关基因共同参与的信号通路。最后,对分析结果进行解析。2.基于网络药理学分析结果,设计细胞实验探讨乌头汤对CCR5 Signaling in Macrophages的调节作用,具体步骤如下：设正常组、模型组(MIP-1β,25 nM)、乌头汤给药组(WTD,20μg/mL、40μg/mL)和阳性对照组(Maraviroc,1μM),其中阳性对照组使用的马拉维罗(Maraviroc,MVC)是一种可以阻断CCR5的药物。收集生长状态良好的U937细胞,计数,将细胞悬液的浓度调整至5×105个/mL,向细胞悬液中加入PMA使其浓度为10ng/mL,铺6孔板,每孔加2 mL细胞悬液。48 h后,弃去旧培养基,用PBS缓冲液洗2遍,正常组和模型组加入2 mL新鲜的完全培养基,乌头汤给药组分别加入2 mL含有20μg/mL和40μg/mL乌头汤的新鲜完全培养基,阳性对照组加入2 mL含有1μM MVC的新鲜完全培养基,孵育2h后,除正常组外,其余各组均加入刺激剂MIP-1β,使其终浓度为25 nM,刺激10 min后收集各组细胞,Western Blot法检测CCR5、p-pkc δ、pkcδ、p-p38及p38的表达水平。另做一批细胞,同样的操作步骤,用MIP-1β刺激24 h后收集细胞上清,ELISA法检测趋化因子RANTES的含量。3.设计动物实验进一步验证乌头汤对信号通路CCR5 Signaling in Macrophages的调节作用,具体步骤如下：选用SD大鼠造胶原诱导关节炎模型(Collagen InducedArthritis, CIA),设正常组(N)、模型组(M)、乌头汤低剂量组(WL,3.75g/kg/d)、乌头汤高剂量组(WH,7.5g/kg/d)和甲氨蝶呤组(MTX,1 mg/kg/w),每组8只,灌胃给药4周,灌胃体积为1 mL/100 g。药物治疗期间观察大鼠的一般情况,每3天称重、评分一次。治疗结束后,采用HE染色法观察大鼠踝关节组织病理变化并进行病理学评分,使用ELISA法检测大鼠血清中趋化因子MIP-1α、MIP-2、RANTES、IP-10和MCP-1的含量,选用Real-time PCR法检测大鼠踝关节中趋化因子MIP-1α、RANTES和IP-10的mRNA的相对表达水平,利用免疫组织化学染色法和Western Blot法检测大鼠踝关节局部CCR5、pkcδ和p38的含量以及pkc δ和p38的磷酸化水平。结果：1.网络药理学分析结果：共得到乌头汤的化学成分174个(制川乌8个、麻黄47个、黄芪22个、白芍15个、炙甘草82个),乌头汤的人源靶蛋白186个(制川乌1个、麻黄119个、黄芪11个、白芍7个、炙甘草48个),RA相关的人源基因831个。IPA分析得到12个乌头汤的分子网络和25个RA疾病分子网络,从乌头汤靶蛋白和RA相关基因共同调节的生物功能可以看出乌头汤可能通过调节炎症响应、造血系统的发展与功能、细胞与细胞间的信号交流等生命活动实现治疗RA的作用。乌头汤的靶蛋白共参与346条信号通路,RA相关基因共参与394条信号通路,其中有314条信号通路是乌头汤靶蛋白和RA相关基因共同参与的。这些共同参与的信号通路中,与细胞免疫相关的前10位信号通路分别为：(1)CCR5 Signaling in Macrophages; (2)Prolactin Signaling; (3) Calcium-induced T Lymphocyte Apoptosis; (4) IL-8 Signaling; (5) fMLP Signaling in Neutrophils; (6)Natural Killer Cell Signaling; (7)NF-κB Activation by Viruses; (8) IL-12 Signaling and Production in Macrophages; (9) Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis in Macrophages and Monocytes; (10) Leukocyte Exstravasation Signaling。我们重点关注排在第一位的CCR5 Signaling in Macrophages,该信号通路与炎症响应有关,能调节趋化因子及炎症介质的表达,在该通路中,pkc和p38既是乌头汤的靶蛋白又是RA相关的基因。2.细胞实验结果：ELISA结果显示与正常组相比,模型组用MIP-1β刺激U937细胞24 h后,细胞上清中RANTES的含量显著升高(P<0.05),与模型组相比,乌头汤给药组和阳性对照组的细胞上清中RANTES的含量均明显降低(P<0.05)；Western Blot结果显示与正常组相比,模型组用MIP-1β刺激U937细胞10 min后,pkc δ和p38的磷酸化水平显著升高(P<0.01),与模型组相比,乌头汤给药组和阳性对照组细胞中pkc δ和p38的磷酸化水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)。但是各个组的CCR5水平没有显著性差异(P>0.05)。3.动物实验结果：关节炎评分和组织病理结果显示乌头汤能有效缓解CIA大鼠的严重程度；ELISA结果表明乌头汤能降低CIA大鼠血清中趋化因子MIP-1α、MIP-2、 RANTES、IP-10和MCP-1的含量(P<0.05或P<0.01)；Real-time PCR结果显示乌头汤能降低CIA大鼠踝关节中趋化因子MIP-1α、RANTES和IP-10的mRNA的相对表达水平(P<0.05或P<0.01)；免疫组化和Western Blot结果表明乌头汤能减少CIA大鼠踝关节中CCR5的含量(P<0.05)以及pkc δ和p38的磷酸化水平(P<0.05或P<0.01)。结论：1.本研究采用网络药理学方法分析得到乌头汤治疗RA的重要信号通路CCR5 Signaling in Macrophages。2.体内实验证实乌头汤对CIA大鼠有一定治疗效果。3.体内外实验证实乌头汤可能通过下调信号通路CCR5 Signaling in Macrophages中pkc δ和p38的磷酸化及趋化因子的表达发挥治疗作用。