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雌激素对心肌缺氧/复氧损伤具有保护作用的研究虽然有许多报道,但是,有关研究雌激素对心肌保护的机制的报道较少。因此,有必要进行深入的研究。17β-雌二醇(17beta-estradiol,E2)除具有促进生殖系统发育和维持生殖功能外,对心血管等器官还有保护作用。主要有抗炎作用、抗氧化作用、抗凋亡作用等。心肌细胞具有雌激素受体(estrogen receptor,ER),细胞活动受到17β-雌二醇调控。本研究建立培养新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型,研究雌激素对心肌细胞的抗炎和抗氧化作用的机制。本研究分为三章。第一章17β-雌二醇对心肌缺氧/复氧保护作用的研究建立缺氧/复氧损伤模型,模拟心肌缺血再灌注损伤。实施外源性一定剂量的(E2 5μM)孵育,通过a–Actin免疫组化染色进行心肌细胞鉴定、通过倒置显微镜进行形态学观察、同时检测上清液中CK、LDH、MDA含量,通过激光共聚焦显微镜检测钙瞬变和钙浓度,采用MTT和流式细胞仪AnnexinⅤ和PI双染实验检测细胞凋亡率和存活率。结果表明:培养的新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤可导致细胞收缩、折光率下降、细胞突起减少;培养上清液中LDH、CK和MDA含量与对照组比较分别升高5.1倍、10.2倍和8.2倍;自发性钙瞬变的幅值和时程均有增加,钙超载明显;中晚期凋亡细胞比对照组升高了10.83%,细胞存活率降低了40.9%。E2预处理可以减少心肌缺氧/复氧损伤,形态学损伤明显减轻,细胞培养上清液中LDH、CK和MDA分别比损伤组降低到2.7倍、2.7倍和2.4倍;钙瞬变的幅值和时程与损伤组比较均有降低,与对照组无明显差异;中晚期凋亡细胞比损伤组下降了9.32%;细胞存活率升高26.45%。E2具有明显的保护细胞的作用。其作用主要是能保护心肌细胞形态和胞膜的完整性,减少心肌酶的渗漏,减少缺氧/复氧造成的钙瞬变幅值和时程增加,抑制心肌细胞凋亡,保护心肌细胞活性,提高心肌细胞的存活率。第二章17β-雌二醇对缺氧/复氧心肌NF-κB及ICAM-1和VCAM-1表达影响机制研究通过RT-PCR和ELISA观察E2对ICAM-1、VCAM-1表达的影响;通过流式细胞仪术和Western blot及激光共聚焦显微镜观察E2对NF-κB核转移和亚细胞定位的影响;通过RT-PCR和ELISA观察E2对NF-κB抑制蛋白I-κB表达的影响。结果表明:E2对缺氧/复氧心肌ICAM-1和VCAM-1mRNA和蛋白表达有明显的抑制作用(P<0.05),阻止NF-κB核转移(P<0.05)。通过PDTC干预实验,分析了ICAM-1和VCAM-1mRNA水平和蛋白表达与NF-κB核转移的相关性。总结了E2对ICAM-1和VCAM-1mRNA水平和蛋白表达的抑制作用是通过阻止NF-κB核转移实现的。E2对缺氧/复氧心肌NF-κB胞浆抑制蛋白I-κB mRNA水平和蛋白表达的影响不显著。E2抑制ICAM-1和VCAM-1的表达,减少心肌细胞缺氧/复氧产生过度的炎性反应。E2阻止NF-ΚB核转移,减少NF-ΚB入核量,抑制炎性因子的表达,降低心肌细胞缺氧/复氧诱导的炎性反应和炎性损伤。I-ΚB表达受NF-ΚB调控,再通过负反馈调节,调控NF-ΚB入核量。E2对I-ΚB表达没有影响。第三章17β-雌二醇对缺氧/复氧心肌Nrf2及GST和GCL表达影响机制研究通过RT-PCR和ELISA观察E2对GST、GCL表达的影响;通过Western blot及激光共聚焦显微镜观察E2对Nrf2核转移和亚细胞定位的影响;通过RT-PCR和ELISA观察E2对Nrf2结合蛋白Keap1表达的影响。结果表明:E2对缺氧/复氧心肌GST和GCL mRNA和蛋白表达有明显的促进作用(P<0.05),增强细胞的抗氧化能力。E2的抗氧化作用与Nrf2/ARE抗氧化系统有密切关系。对核转录因子Nrf2的入核过程有促进作用(P<0.05)。使下游的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶表达上调,增强抗氧化作用,保护细胞活性。E2对核转录因子Nrf2的胞浆结合蛋白Keap1 mRNA水平和蛋白表达的影响不显著。E2能增强GST和GCL的表达增强心肌细胞的抗氧化能力,减少过氧化损伤,保护细胞活性。E2能促进Nrf2核转移增加Nrf2入核量加强抗氧化元件ARE对抗氧化酶和Ⅱ相酶基因的调控。E2对Keap1表达没有影响。