土壤次生盐渍化是温室蔬菜生长的主要障碍之一，严重影响栽培设施的利用效率和设施蔬菜栽培的可持续高效发展。温室土壤的盐分组成特点和滨海、内陆盐土不同，其阴离子主要是NO3-。目前前人对盐胁迫对植物的伤害机理方面的研究已取得了长足进展，但多以NaCl处理作为研究手段，而温室土壤中NO3-积累造成蔬菜伤害的分子机理缺乏深入系统的研究。黄瓜是我国日光温室主栽的蔬菜种类之一，黄瓜根系浅，吸肥能力差，易受盐害。因此，研究设施黄瓜在NO3-胁迫条件下的抗性机理具有重要的理论和实践意义。 MAPK级联途径是真核生物中广泛存在的逆境胁迫信号转导途径。MAPK级联途径由三类蛋白激酶组成：MAPKKK-MAPKK-MAPK，通过依次磷酸化传递环境信号。植物中的MAPK途径与其他信号途径交织在一起，形成了一个网络系统，参与生长发育和各种生物、非生物胁迫信号转导。近年来，在植物中分离到大量MAPKs，并在其作用机理研究方面取得了很大进展。然而，前人对植物中MAPK的研究主要集中在双子叶模式植物(拟南芥、烟草和紫花苜蓿等)，关于黄瓜MAPK方面的研究很少。为此，本试验以黄瓜为试材，对黄瓜MAPK进行了基因克隆、表达特性和功能的研究，主要结果如下： 1.利用同源序列设计兼并引物，通过RT-PCR的方法，在黄瓜根中分离到黄瓜MAPK基因的中间片段，再通过5RACE和3RACE分别克隆到黄瓜MAPK基因的5片段和3片段，拼接后设计特异引物扩增到黄瓜MAPK基因全长cDNA，命名为CsNMAPK(基因注册号：DQ812086)。该基因全长1636 bp，有开放阅读框1113 bp，编码370个aa。 2.同源序列比较发现，黄瓜MAPK基因与已知的棉花、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、辣椒的同源性分别为85.18％、84.91％、84.64％、83.65％、83.11％、81.60％。对来自番茄、马铃薯、棉花等MAPK蛋白进行分子聚类分析，构建了MAPK蛋白的系统进化树，分析结果表明，CsNMAPK蛋白与棉花GmMAPK1、豌豆的PsMAPK3蛋白亲缘关系最近。聚类分析还表明CsNMAPK蛋白属于MAPK的I类，预示可能在环境胁迫和激素信号转导中起着重要作用。 3.Northern blot分析表明CsNMAPK受NO3-胁迫强烈诱导表达。56、98、140 mM NO3-处理后，该基因的表达量上升，182 mM NO3-处理后该基因的表达量下降。182 mM NO3-处理后该基因在黄瓜叶、茎和根中均有表达，且表达量差异不大。182 mM NO3-处理耐盐品种‘新泰密刺’10 min后该基因的表达量开始上升，处理30 min后表达量达到最大，随后开始下降：而盐敏感品种‘神农春五’的表达量在60 min达到最大。CsNMAPK也能被NaCl、ABA、H2O2、PEG和SA等诱导。 4.利用农杆菌侵染法将pBI-CsNMAPK转入烟草中，通过PCR和Northern blot检测表明CsNMAPK已经插入烟草基因组中并且已经表达。通过种子萌发期NO3-抗性试验表明，转基因烟草种子的抗性提高。通过苗期NO3-胁迫试验表明，转基因烟草抗性提高。为了检测转CsNMAPK基因烟草抗性提高的原因，我们测定了一系列和植物逆境胁迫有密切关系的生理指标，包括MDA含量、膜透性、H2O2含量、抗氧化物酶活性(SOD、POD、CAT、APX)、净光合速率、游离脯氨酸的积累等。结果表明，未处理的转基因烟草和野生型烟草的这些指标没有明显差别。但是胁迫处理后，转基因植株中电解质相对渗漏率、MDA和H2O2含量都显著低于野生型植株；转基因植株中SOD、CAT、POD和APX酶活性均高于野生型植株，具有更高的活性氧清除能力；脯氨酸含量增加的更多，具有较强的渗透调节能力。 5.构建了原核表达载体pET-CsNMAPK，并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白，免疫小白鼠，制备抗体。Western杂交表明，转正义植株中CsNMAPK已在蛋白水平过量表达。 6.用子房注射法将携带CsNMAPK基因的正义和反义表达载体的质粒导入六个黄瓜品种中，T1代幼苗叶片用2500 mg/L的卡那霉素涂抹筛选，对未变黄的植株进行PCR和Real-time PCR检测，获得了8株转基因黄瓜植株，其中3株反义转基因植株，5株正义转基因植株。