背景电磁场如今广泛运用于人们生活中,它对人类健康的影响也越来越受到关注。电磁场与肿瘤的关系迄今仍没有明确定论,一方面国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)根据一些流行病学研究结果将低频电磁场定义为潜在致癌物(2B类)。另一方面有证据表明电磁场具有抑瘤作用,例如以Optune为代表的电磁场发生仪器产生的电磁场已被用于临床脑胶质细胞瘤治疗。电磁场的热效应主要发生在100 k Hz以上,而在低频电磁场则可诱导出多种生物学效应。针对电磁场生物效应的深入研究或许能阐明电磁场与肿瘤之间的关系。肾母细胞瘤是儿童第二常见腹部实体肿瘤,发病率在15岁以下的儿童中约为7-10/100万,属胚胎恶性混合瘤。肾母细胞瘤由一个或多个基因突变引起,特异的基因是Wilms’tumor gene-1。98%的肾母细胞瘤病例发生于10岁以下,平均发病年龄为3.5岁。得益于外科手术和放化疗的综合治疗模式,其总体5年生存率可达约90%。然而肾母细胞瘤的临床疗效往往取决于患者的肿瘤病理分期和肿瘤细胞的分化状态等因素。对于复发和死亡风险显著增强的肾母病例如病理类型为间变型、透明细胞型、横纹肌肉瘤型;肿瘤分期为Ⅳ期、Ⅴ期;染色体1p和16q染色体杂合性缺失等病例预后差,5年生存率大幅降低。基于上述情况,我们考虑将电磁场治疗作为高度恶性肾母细胞瘤传统化疗的辅助治疗并针对电磁场抑瘤机制、化疗增敏和毒副作用进行研究。方法在本学位论文中,我们采用了一种由静电磁场调制的50 Hz工频电磁场,磁场平均强度为5.1 m T。我们以多种肿瘤模型研究了该磁场对肿瘤细胞的抑制率和选择性,并进一步以肾母细胞瘤细胞G401为模型研究了肿瘤抑制性磁场对细胞命运的影响和具体的抑瘤机制。在细胞命运影响方面我们采用Ed U标记法检测细胞增殖情况;细胞流式法和蛋白印迹法中凋亡蛋白表达水平来检测凋亡;自噬潮检测、免疫荧光中自噬蛋白表达水平和自噬溶酶体水平来检测自噬;经铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对磁场暴露诱导的细胞抑制的影响来检测铁死亡;经细胞流式术检测细胞周期。在抑瘤机制方面,重点探究了磁场诱导细胞内活性氧含量增加以及继发的DNA损伤以及修复情况,并探索了自由基清除剂的逆转效应。实验结果1肿瘤抑制性磁场对肾母细胞瘤的抑瘤效果细胞活力实验结果显示该磁场对大多数细胞系生长具有抑制作用,而肿瘤细胞比相对正常的细胞对磁场更加敏感。磁场暴露2小时,肾母细胞瘤G401、肺癌A549、胃癌SGC-7901和胰腺癌PANC-1的抑制率均显著高于相应的正常组织细胞系。当磁场暴露时间累计达到4和6小时,即磁场暴露的第二天和第三天,抑制效应持续且抑制率达峰值:第二天SGC-7901抑制率为22%,第三天G401抑制率为29%,A549抑制率为30%,PANC-1抑制率为24%。G401接受0.5、1、2小时磁场暴露处理或假暴露处理,共计3天,计算每组细胞抑制率,结果表明在同一天的实验中,长时长磁场暴露比短时长产生更强的抑瘤效应,此外,高剂量磁场暴露2 h/d组在三天实验中抑制率逐渐升高,抑制率与磁场暴露剂量(时长)具有量效关系。对于化疗增敏的研究,在体外实验中肿瘤抑制磁场与两类化疗药物分别及联合作用于肾母细胞瘤G401细胞和肺癌A549细胞。结果显示磁场暴露联合化疗显著增加了细胞抑制率,磁场暴露使G401细胞对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和长春新碱(vincristine,VCR)敏感性增加,使A549细胞中对顺铂(cisplatin,DDP)和紫杉醇(paclitaxel,PTX)敏感性增加。从处理第一天即观察到电磁场对化疗药显著的增敏作用,增敏效应持续到第二天和第三天。在体内实验中,磁场暴露和DDP联合应用可明显抑制肾母肿瘤生长。对于肿瘤抑制性磁场毒副作用的研究我们进行了体内实验,32只G401肾母细胞瘤植瘤裸鼠分为4组,分别接受磁场暴露、DDP、磁场暴露联合DDP、假暴露对照处理。裸鼠结果显示接受磁场暴露处理或DDP处理的裸鼠生长正常,组间治疗后小鼠体重无显著性差异。采取裸鼠血样检测肝功能,组间血浆白蛋白(Alb)和球蛋白(Glb)水平没有变化;而谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)在DDP组和联合组均显著升高。单纯磁场暴露组肝肾功能Alb、Glb、AST、ALT四项肝功能指标较假暴露对照均无变化,表明其磁场暴露本身不引起肝肾毒副作用。不过联合治疗组的肝功能指标AST和ALT水平均较单纯DDP组升高约10%。各组肾功能未发现显著变化。综上,磁场暴露引起的全身毒副作用较低。2肿瘤抑制性磁场对肾母细胞瘤的抑瘤机制Ed U标记法检测细胞增殖结果显示G401细胞经磁场暴露处理第二天假暴露对照组为34.53%,磁场暴露组增殖率为21.01%,下降幅度达13.52%。第三天实验中,假暴露组增殖率31.57%,磁场暴露组为20.01%,下降幅度达11.56%。在体外实验中,流式检测显示G401经磁场暴露处理第三天,凋亡率较假暴露组显著升高。在体内实验中,蛋白印迹显示裸鼠肾母细胞瘤种植瘤中磁场暴露组凋亡标志蛋白cleaved caspase3较假暴露组显著增加。自噬潮检测中,蛋白免疫印迹显示磁场暴露联合Baf-A1与单独Baf-A1处理的G401相比,LC3-Ⅱ与LC3-I的比值显著增高,该趋势在实验第二天和第三天更为明显。溶酶体探针检测细胞溶酶体活性则发现G401磁场暴露处理第二天即磁场暴露时间累计为4小时,指示溶酶体的红色荧光较假暴露组明显增强。此外,G401经磁场暴露2天后免疫荧光显示细胞内自噬标志物蛋白LC3和溶酶体蛋白LAMP1的表达和两者共定位均较假暴露组增加。我们还发现G401细胞经磁场暴露处理后m TOR通路受到抑制。m TOR磷酸化水平在磁场暴露0.5、1、1.5小时这三个时间点均受到抑制,在1小时最显著。p70 S6 kinase的Thr389位点和Ser371位点在0.5、1、1.5和2小时四个时间点磷酸化水平均有抑制,0.5小时最显著。综上,肿瘤抑制性磁场促进肾母细胞瘤G401细胞内自噬水平增加,溶酶体活性增强,自噬溶酶体数目增加,m TOR通路抑制。细胞周期流式检测结果显示对照组(假暴露组)G2/M期占比7-10%,磁场暴露两小时后G2/M期增加至29.25%,磁场暴露4小时后G2/M期增加至33.36%。在经胸苷双阻断同步化后的G401细胞中假暴露组G2/M期占比31-36%,磁场暴露两小时后G2/M期增加至52.69%,磁场暴露4小时后G2/M期增加至65.70%。上述结果表明磁场暴露将G401细胞阻滞于G2/M期,且呈现随磁场暴露时间增长阻滞的细胞占比也增加。此外,G401细胞在磁场暴露处理2小时和4小时后细胞内Chk1和Chk2磷酸化水平升高,Cyclin B1表达量增加。铁死亡检测结果显示G401经磁场暴露后MDA水平显著升高,NADPH含量显著下降。磁场暴露和铁死亡抑制剂Fer-1联合处理第三天G401细胞生长抑制率是13.37%,较单纯磁场暴露组有显著下降,结果表明铁死亡抑制剂能部分拯救磁场暴露诱导的G401细胞生长抑制。综上,肿瘤抑制性磁场能促进G401铁死亡。ROS水平检测结果显示G401细胞经磁场暴露处理后,在0.5、1、1.5小时这三个处理时长中G401细胞内ROS水平均有增高,并于0.5小时达到峰值。此外结果还显示磁场暴露处理结束24小时ROS水平仍显著高于假暴露组,表明G401经肿瘤性抑制磁场诱导的ROS水平升高且具持续性。G401经磁场暴露和ROS清除剂NAC联合处理后,生长抑制率显著低于假暴露组。第一天磁场暴露抑制率17.2%,联合NAC后抑制率下降至9.37%;第二天磁场暴露抑制率19.86%,联合NAC后抑制率下降至3.74%;第三天磁场暴露抑制率30.88%,联合NAC后抑制率下降至9.11%。结果表明自由基清除剂NAC能部分逆转磁场暴露诱导的G401细胞生长抑制。彗星实验结果显示磁场暴露后G401细胞DNA片段化水平均高于假暴露组,也即磁场暴露诱导了G401细胞产生DNA损伤。碱性彗星实验和中性彗星实验检测细胞DNA损伤结果显示:第二天碱性彗星实验磁场暴露组DNA片段化占比40.73%而中性彗星实验中DNA片段化占比16.7%;第三天碱性彗星实验DNA片段化占比56.73%,中性彗星实验DNA片段化占比35.88%,表明磁场暴露诱导的G401细胞同时产生单链和双链DNA损伤,并以DNA双链损伤为主。此外,碱性彗星实验显示联合NAC后,在第二天和第三天DNA片段化占比较单纯磁场暴露组显著下降,中性彗星实验显示联合NAC后,第三天DNA片段化占比较单纯磁场暴露组显著下降。也即磁场暴露诱导的DNA损伤由ROS介导。γH2AX焦点形成实验结果显示G401经磁场暴露后的三天G401细胞内指示DNA双链损伤修复的绿色荧光焦点形成平均数均较假暴露组增加,其中第二天的增加具统计学差异。对于DNA损伤修复相关基因表达水平检测,体内实验中G401经磁场暴露处理2小时后细胞内BMI1,LIG4和RAD9B的表达水平较对照组均有显著提高。体外实验中磁场暴露组肿瘤组织中LIG4和RAD9B的表达水平较假暴露组有显著提高。而细胞经流式细胞术检测双链DNA-PKcs经磁场暴露处理后在细胞内的表达水平较假暴露组显著升高。而DNA-PKcs和LIG4作为非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)的主要成员参与DNA双链修复。此外,Chk1和Chk2的磷酸化参与了另一种DNA损伤修复方式,即同源重组(homologous recombination,HR)。综上,磁场暴露在诱导肾母细胞瘤G401产生DNA损伤的同时激活了DNA损伤修复系统。结论根据以上研究结果,我们作出以下结论:1)该肿瘤抑制性磁场对肿瘤细胞的抑制具有广谱性和选择性,即对多种肿瘤细胞有抑制效应,同时对正常细胞的影响较小;2)该肿瘤抑制性磁场暴露治疗的特点是多靶点多机制,在肾母细胞瘤中,该磁场可从多方面影响细胞命运,包括抑制增殖、促进凋亡、诱导自噬、阻滞细胞周期和诱导铁死亡;3)该肿瘤抑制性磁场诱导肾母细胞瘤细胞内ROS水平升高,进而介导的DNA损伤,同时激发DNA损伤应答;4)该肿瘤抑制性磁场对化疗有体内外增敏效应同时全身毒副作用低,具有临床转化的潜力和优势。本学位论文主要创新点本学位论文主要获得以下创新结果:1)提出肿瘤抑制性磁场影响肿瘤细胞命运具有多靶点多机制的特点,首次提出磁场暴露诱导肾母细胞瘤细胞发生铁死亡;2)提出ROS升高介导的DNA损伤是肿瘤抑制新磁场抑制肾母细胞瘤的主要机制;3)肿瘤抑制性磁场对化疗有增敏效应同时低毒副作用,具有转化潜力。