鸡的产蛋性状是鸡非常重要的经济性状之一,鸡的产蛋性状主要与卵泡的调控发育有关,影响卵泡发育的因素有很多,主要受垂体分泌的FSH、LH、卵泡内局部因子GDF9以及一些信号通路的影响。有研究表明,Hippo/MST信号通路与卵泡发育密切相关,该信号通路通过调节下游基因的表达,调节细胞的生长、增殖和凋亡,从而参与调控器官大小和组织再生。Hippo/MST信号通路在哺乳动物和果蝇上的研究较多,但在鸡卵泡发育上却鲜有报道。本研究以海兰褐蛋鸡(Hy-Line Brown layers)为实验材料,分别采用免疫组化、免疫共沉淀、过表达等实验方法,最终确定MST1、MST2、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1为鸡Hippo/MST信号通路的主要成员,初步揭示了这六个因子及MST4在前等级卵泡上的时空表达模式、它们之间的互作关系及SAV1基因对生物标记基因FSHR、StAR、GDF9和CCND2 mRNA表达水平和颗粒细胞增殖的影响,为揭示产蛋性状形成的遗传调控机制提供参考依据。主要研究及结果如下:1.鸡MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1基因在卵泡中的mRNA表达本实验初步筛选MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1五个基因为Hippo/MST信号通路参与鸡卵泡发育调节的候选因子,首先用定性PCR的方法确定MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1五个基因在鸡卵巢的前等级卵泡(直径1-3.9 mm、4-4.9 mm、5-5.9 mm、6-6.9 mm、7-8 mm)和等级卵泡(F6-F5、F4-F3、F2-F1)中特异表达,然后用实时荧光定量PCR对五个基因在不同直径大小卵泡中的mRNA表达量进行测定分析。结果显示,MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1五个基因随着卵泡的不断发育,mRNA表达量逐渐减少,在前等级卵泡中的整体表达量显著大于等级卵泡(P<0.05)。说明本实验选取的五个基因与卵泡的增殖发育有密切关系,但具体机制及作用原理还需要进一步的验证。2.鸡MST4、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1蛋白在卵巢中的时空表达模式利用免疫组化方法对鸡MST4、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1蛋白质分子在鸡卵巢卵泡中的时空表达、定位进行检测分析。结果显示,MST4、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1五个蛋白在鸡前等级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,而在膜层细胞中均未发现其蛋白质水平上的表达分布。说明MST4、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1蛋白质分子可能以自分泌或旁分泌方式共同参与了前等级卵泡发育的调控,对卵泡生长发育发挥着关键生物学功能。3.MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1互作关系的检测、鉴定用免疫共沉淀(IP)方法验证五个目的蛋白(MST4、SAV1、MOB2、LATS1和YAP1)之间是否存在相互作用,利用Western blotting方法进行检测、鉴定,并预测互作顺序。结果显示,SAV1与MOB2、SAV1与LATS1、MOB2和YAP1之间均相互作用。4.过表达MST4基因对Hippo/MST信号通路其他成员的影响通过构建重组质粒,转染至体外培养的前等级卵泡颗粒细胞内,从核酸水平检测SAV1、LATS1、MOB2和YAP1基因在MST4基因过表达组和对照组中的影响,并从蛋白水平验证结论。结果显示:重组真核表达质粒pcDNA3.1-FLAG-MST4构建成功,并成功转染到颗粒细胞系中稳定生长。过表达MST4之后,MOB2、SAV1、LATS1、YAP1四个基因表达量变化较小,差异不显著,Western blotting结果与RT-PCR结果一致,过表达MST4后对SAV1、LATS1、MOB2和YAP1影响均不明显,因此推测MST4可能不是鸡前等级卵泡Hippo/MST信号通路的核心成员。5.SAV1基因siRNA干扰对Hippo/MST信号通路其他成员的影响为探讨SAV1基因调控鸡前等级卵泡生长发育的作用,本实验通过检测siRNA干扰SAV1基因后前等级卵泡中LATS1、MOB2、YAP1基因mRNA表达水平,以明确SAV1基因对LATS1、MOB2和YAP1 mRNA表达的可能影响或调控作用,并验证目的基因之间的联系以及上游基因变化时,下游基因表达量的变化规律。结果显示:当下调SAV1基因mRNA表达时,LATS1和YAP1基因mRNA的表达量却升高,说明SAV1基因在前等级卵泡发育过程中对下游基因LATS1和YAP1具有抑制作用。6.SAV1抑制鸡前等级卵泡生长发育的作用通过免疫共沉淀实验发现MST1、MST2与SAV1之间有相互作用,并且SAV1可通过激酶MST1和MST2的诱导显著磷酸化LATS1。当siRNA干扰SAV1基因后,BrdU掺入法实验显示前等级卵泡颗粒细胞增殖水平显著提高,GDF9、StAR和FSHR基因mRNA表达量显著增加,同时过表达实验也对此结果进行了验证。说明SAV1可以抑制颗粒细胞的增殖,而且对生物标记基因GDF9、St AR和FSHR的表达呈显著抑制作用。本实验表明:SAV1作为Hippo/MST信号通路的一员,在前等级卵泡发育过程中发挥抑制作用,而LATS1和YAP1对前等级卵泡发育具有促进作用。本研究明确了鸡Hippo/MST信号通路核心成员包括MST1、MST2、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1。证明了SAV1和MST1、MST2、MOB2、LATS1之间以及MOB2和YAP1之间的相互作用,确定了通路的上下游关系为MST1/2—SAV1—MOB2/LATS1—YAP1。检测表明MST4、SAV1、LATS1、MOB2和YAP1主要在前等级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中表达,其表达量会随着卵泡发育而逐渐减少。通过磷酸化、过表达等实验,证明了核心因子SAV1通过激酶MST1和MST2的诱导磷酸化LATS1,对前等级卵泡发育具有抑制作用,同时表明LATS1和YAP1对前等级卵泡发育具有促进作用,MST4不是Hippo/MST信号通路核心成员,但在前等级卵泡发育过程中仍发挥一定调控作用。本研究揭示了Hippo/MST信号通路参与调控鸡前等级卵泡生长发育的调控作用及分子机制,进一步完善了鸡卵泡发育的调控网络,可为深入研究卵泡优势选择和等级化建立的遗传机理提供了理论依据,也为深入发掘控制鸡产蛋数量的相关基因,提高产蛋性状奠定了分子基础,具有十分重要的科学意义和应用前景。