【摘 要】
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白姜花具有洁白的颜色、美丽的花型和迷人的芳香,浓郁的香气主要由沉香醇、（E）-β-罗勒烯、1,8-桉油醇、（E,E）-α-金合欢烯等萜类物质和苯甲酸甲酯等苯基/苯丙烷类物质组成。然而,这些物质的代谢调控机理仍不明确。生长素作为重要的植物激素参与调控花发育进程以及多种次生代谢产物的合成,但其调控有关挥发性次生代谢产物的报道很少。本研究分析了IAA作用抑制剂处理对姜花花香释放的影响,测定了姜花花瓣发育
【基金项目】
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国家自然科学基金（31370694 和 3177030012）； 教育部博士点基金（20134404110016）； 广州市民生科技攻关计划（201903010054）；
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白姜花具有洁白的颜色、美丽的花型和迷人的芳香,浓郁的香气主要由沉香醇、（E）-β-罗勒烯、1,8-桉油醇、（E,E）-α-金合欢烯等萜类物质和苯甲酸甲酯等苯基/苯丙烷类物质组成。然而,这些物质的代谢调控机理仍不明确。生长素作为重要的植物激素参与调控花发育进程以及多种次生代谢产物的合成,但其调控有关挥发性次生代谢产物的报道很少。本研究分析了IAA作用抑制剂处理对姜花花香释放的影响,测定了姜花花瓣发育过程中内源IAA含量,结合姜花香气物质的变化规律,系统分析了生长素及其信号在调控香气物质合成的作用。利用生物信息学手段鉴定了生长素信号元件Aux/IAA家族蛋白,筛选出了与香气物质合成代谢相关的关键基因。鉴定了受生长素诱导的R2R3-MYB转录因子,以及生长素转录因子ARF,通过分子生物学实验鉴定到两者的靶向调控基因为花香关键合成酶基因。主要研究结果如下:1.生长素作用抑制剂2-（4-氯苯氧基）异丁酸（PCIB）处理姜花后,花香挥发性物质释放量显著降低,萜烯类和苯丙烷类合成途径关键末端酶基因的表达量显著降低;且内源激素IAA和JA含量降低,ABA含量升高;其中JA含量降低显著,为对照的51%。测定姜花花瓣发育进程中内源IAA的含量和花香物质的挥发量,结果表明IAA含量在花蕾期较低,在始开期含量升高,出现小高峰,且在盛开期依然保持高水平,衰败期降低;而花香物质释放却在半开期高,盛花期达到高峰后降低。说明生长素可能是姜花花香释放重要的调控激素,且可能与其它激素共同调控花香的释放。2.通过生物信息学分析,利用姜花基因组和转录组数据分析鉴定出27个Aux/IAA基因,并对其启动子顺式作用元件进行分析,预测结果表明Hc IAAs可能对生长素、脱落酸和乙烯等多种激素产生应答。研究了Aux/IAA家族基因在姜花不同花发育时期、不同器官组织和不同外源激素处理后的基因表达水平,筛选出4个关键的可能参与花香合成的Aux/IAA（Hc IAA2、Hc IAA4、Hc IAA6和Hc IAA12）。对这些候选因子进行亚细胞定位试验,结果表明均定位于细胞核。3.分析了Hc IAA4及其互作蛋白Hc MYB1在生长素及其抑制剂PCIB处理后在m RNA水平和蛋白水平的表达量。Hc IAA4和Hc MYB1在IAA处理6 h后升高,在PCIB处理2 h后表达量降低。两者的蛋白表达水平也受IAA诱导,受PCIB抑制。Hc IAA4和Hc MYB1在酵母体内的互作强度在IAA的诱导下增加59%,在PCIB处理下降低33%。通过双荧光素酶瞬时表达实验表明:Hc IAA4作为Hc MYB1的互作蛋白,显著减弱了Hc MYB1对Hc BSMT2的转录激活能力,可能是一个负效应的互作因子。4.依据转录组信息克隆了两个新的R2R3-MYB转录因子,分别命名为Hc MYB2和Hc MYB3。荧光定量PCR分析表明,Hc MYB2和Hc MYB3均为花部特异表达基因,在不同花发育的表达受到花发育的调控。在外源生长素处理后,Hc MYB2和Hc MYB3的表达量均受到诱导表达,而在生长素作用抑制剂PCIB处理后表达量显著降低,均表明Hc MYB2和Hc MYB3可以对生长素信号产生应答。利用病毒沉默体系,在花瓣中瞬时沉默Hc MYB2后,桉油醇、罗勒烯、沉香醇和苯甲酸甲酯挥发量分别降低17%、18%、68%和37%,同时关键合成酶基因Hc TPS3、Hc TPS5和Hc BSMT2的基因表达量分别降低46%、32%和57%。而沉默Hc MYB3后,仅桉油醇的释放量降低45%,其它主要挥发性物质释放量没有显著变化。5.通过酵母单杂交、双荧光素酶以及凝胶阻滞实验,在体内和体外验证Hc MYB1、Hc MYB2和Hc MYB3的下游靶基因,结果表明:Hc MYB1和Hc MYB2可以靶向转录激活苯甲酸/水杨酸甲基转移酶基因Hc BSMT2的表达,是参与调控苯甲酸甲酯合成的关键转录因子。Hc MYB2靶向转录激活沉香醇合成酶基因Hc TPS5的表达,是参与调控沉香醇合成的关键转录因子。而Hc MYB3不能靶向结合花香关键萜类合成酶基因的启动子元件。利用姜花胚性愈伤组织超表达Hc MYB2,检测具有抗性芽的正义表达转基因愈伤组织,结果表明在抗性芽组织中,Hc MYB2的表达量是对照组的26倍,其靶向调控基因Hc BSMT2和Hc TPS5的表达量分别为对照组的15.6和14.5倍。6.根据转录组信息克隆了生长素转录因子Hc ARF7,进化树分析结果表明,Hc ARF7和单子叶水稻Os ARF7亲缘关系最近。荧光定量结果分析表明,Hc ARF7是在多种组织均有表达的转录因子;在盛花期高丰度表达。酵母双杂交实验表明,Hc ARF7与生长素信号转导元件蛋白Hc IAA4和Hc IAA6相互作用。酵母单杂交和双荧光素酶实验证实,Hc ARF7靶向转录激活罗勒烯合成酶基因Hc TPS3的表达,是参与调控姜花罗勒烯合成的关键转录因子。
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