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低温是影响植物生长和作物产量的重要环境因子。当温度低于0℃时,由于细胞外的水分凝结成冰晶,植物细胞同时遭受到脱水胁迫和机械胁迫。低温胁迫降低质膜的完整性,导致细胞内溶物包括ATP释放到胞外。胞内ATP通过主动转运或被动扩散释放到胞外后,胞外的ATP(extracellular ATP,eATP)就成为重要的信号分子。eATP信号参与调控多种生理过程,且其介导的生理反应依赖于eATP的浓度。另外,eATP在调节防御反应中起重要作用。研究表明,eATP信号参与植物对多种环境胁迫的响应,比如病原体入侵、机械损伤、高盐胁迫和高渗胁迫。但eATP是否参与植物对低温胁迫的响应,目前还属未知。在动物和植物中,胞外三磷酸双磷酸核苷水解酶(Ecto-apyrase)是调控eATP水平的关键酶。对模式植物拟南芥的研究表明,拟南芥中的Apyrase参与调节植物生长和防御反应,包括花粉管的萌发、棉纤维伸长、根毛生长以及气孔运动等。研究表明有Apyrase可能通过调节eATP信号参与植物对胁迫刺激的应答。然而,对于高等植物中的Apyrase是否在低温下调节eATP信号、及其与低温耐受性的关系至今尚未有报道。本文对木本植物Apyrase和eATP在植物耐受低温胁迫中的作用进行研究。我们选择胡杨为研究材料。胡杨是分布于我国西北地区重要的木本植物,它具有较强的耐盐碱、耐低温的能力,对保持生态环境、防风固沙具有重要作用。另外,胡杨还能适应盐碱荒漠地带极端的温度变化。我们发现,低温胁迫导致胡杨愈伤细胞质膜的完整性受损,从而使eATP含量的升高。与之相对应是,低温处理诱导了胡杨Apyrase基因PeAPY2的表达,却对胡杨中另一个Apyrase同源基因PeAPY1的表达没有促进作用。因此,我们推测PeAPY2可能参与胡杨对低温胁迫的适应过程。为了验证这一推论,我们从胡杨细胞中克隆了PeAPY2基因的全长编码区,并研究了其在植物耐受低温胁迫中的功能。主要结论如下：1. 我们将PeAPY2-YFP融合蛋白在洋葱表皮细胞和拟南芥原生质体中进行瞬时表达,发现PeAPY2主要定位于细胞质膜,但在内质网和高尔基体中也有表达,说明PeAPY2可能是通过细胞分泌途径整合于质膜之中。2.通过原核表达系统纯化PeAPY2蛋白,分析了其酶学特性。发现PeAPY2有较广的底物特异性,虽能水解多种嘌呤和嘧啶核苷酸,但PeAPY2对嘌呤核苷酸特别是ATP的亲和力较高。PeAPY2以二价阳离子为辅因子,其中Mg2+的促进作用最强。另外,抑制剂处理实验表明,PeAPY2对多种ATP酶(包括P型、V型、和F型ATP酶)的专一性抑制剂不敏感。3.通过在模式植物拟南芥中异源表达PeAPY2,我们研究了PeAPY2在调控eATP和低温耐受性中的作用。在低温胁迫下,PeAPY2过表达株系的抗低温能力显著提高,表现为冷冻处理时转基因株系的根系生长和存活率显著高于野生型。另外,根据相对电导率和细胞活力实验的结果,PeAPY2过表达株系在低温下质膜的完整性高于野生型。表明在低温胁迫下,PeAPY2增强了转基因植株对质膜损伤的修复能力。4.利用PeAPY2转基因株系,通过进一步分析低温胁迫响应基因和质膜修复基因的表达,发现PeAPY2转基因株系中突触结合蛋白基因(Synaptotagmin 1,AtSYT1)在冷胁迫下显著上调,说明PeAPY2可能借助于SYT1介导的质膜修复提高低温耐性。5.特别重要的发现是,PeAPY2过表达株系在低温胁迫及恢复过程中根细胞的胞吞和胞吐显著增强。研究结果还表明,低浓度的eATP促进囊泡运输,而高浓度的eATP明显抑制囊泡运输,并降低了细胞活力。在低温下,野生型植株eATP含量明显升高,而转基因植株的eATP浓度显著低于野生型植株。表明PeAPY2过表达株系能够有效调控eATP水平,降低高浓度ATP对囊泡运输潜在的抑制作用。综上所述,在低温胁迫下,细胞内ATP通过受损的质膜释放到胞外。eATP过度累积会抑制细胞活力和囊泡运输水平,阻碍低温下的质膜修复,降低植物细胞的低温耐性。PeAPY2通过促进细胞的囊泡运输,提高低温下细胞的质膜修复能力,维持细胞的完整性。另一方面,通过降解过多的eATP,减弱eATP对细胞活力和囊泡运输的抑制作用,从而提高了植物的低温耐性。在胡杨中,低温处理的细胞上调PeAPY2的表达。PeAPY2在增强囊泡运输的同时减少了eATP的过度积累,从而降低了高浓度eATP对囊泡运输和质膜修复的抑制作用,最终提高了抗低温能力。