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前言：
机体的免疫功能与肿瘤的发生有密切关系,肿瘤发生后,机体可通过免疫效应机制发挥抗肿瘤作用。目前发现中性粒细胞(Polymorphonuclearneutrophils,PMNs)参与抗肿瘤过程,中性粒细胞由趋化因子募集到达肿瘤部位,产生多种细胞毒性物质如活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS),阮酶类,膜穿孔因子,可溶的细胞杀伤物质,包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白介素一1β(IL-1β),干扰素(IFN)。它还通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(Antibody-DependentCellCytotoxicity,ADCC)杀伤癌细胞。
肿瘤热疗是指用各种方法提高全身和/或肿瘤组织(局部)的温度,利用热作用及其继发效应来治疗恶性肿瘤。近年来全身热疗成为重要的肿瘤辅助性治疗手段。全身热疗的温度不超过42℃,可以诱发自然杀伤细胞、T淋巴细胞和巨噬细胞免疫效应的增强,增强免疫系统的功能,抑制原发瘤和转移瘤的生长。温和全身热疗还能促使机体白细胞重新分布,提高中性粒细胞比例,促进其移行和趋化作用;促进淋巴细胞向二级淋巴器官移动,增强机体免疫监视作用。
大量研究表明,寒冷应激可以对机体的体液免疫和细胞免疫产生影响。一般而言,急性冷应激常呈现免疫抑制,而慢性冷应激常引起免疫增强;温和冷应激常引起免疫增强,过强冷应激则可以引起机体免疫功能严重抑制,致使机体免疫机能下降。
冷热应激能甭对中性粒细胞的生物学功能以及抗肿瘤活性产生影响,目前尚不清楚,本研究埘此进行了研究。
实验方法：
1.实验动物及主要试剂
雌性BALB/c小鼠,6-8w,SPF级。
中性粒细胞分离液,弗波醇PMA,牡蛎糖原,ROS荧光染料DCFH-DA,CFSE,PI,RPMI1640培养液,标准胎牛血清(FBS),PBS粉末,含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶等。
2.实验动物分组及处理
雌性BALB/c小鼠60只,正常小鼠30只和荷瘤鼠30只,各平均分为三组:23℃(对照)组,40℃(处理)组,4℃(处理)组。处理组小鼠分别放在40℃与4℃环境下2h/d,连续处理5d,每天观察记录荷瘤鼠肿瘤大小。
3.样品采集与指标检测
(1)中性粒细胞分离及悬液制备
腹腔注射小鼠1%牡蛎糖原1.5ml,4h后颈椎脱位处死小鼠,常规无菌腹腔灌洗收集腹腔液,中性粒细胞分离液分离纯化,重悬得到中性粒细胞悬液,调整浓度至1×106/ml。
(2)中性粒细胞纯度的检测
吸取20μl中性粒细胞悬液原液,经涂片离心机离心,瑞士吉姆萨双染鉴定中性粒细胞的纯度在90%以上。
(3)中性粒细胞活化产物ROS的检测
吸取中性粒细胞悬液300μl,加入300μ110μM的DCFH-DA,37℃孵育30min,取出后加入8μ110μM的PMA,进行流式检测。
(4)中性粒细胞杀伤靶细胞功能的检测
将中性粒细胞悬液1×106/ml200μl/孔加入到5x104/ml200μl/孔的L929肿瘤细胞中,共同孵育24小时,之后收集细胞,进行流式检测。
(5)MethA肿瘤模型的建立
MethA肿瘤细胞,调整浓度至2×107/ml,接种到BALB/c小鼠背部皮下0.1ml/只。5天后长出肉眼可见实体瘤,成瘤率为80%。
(6)处理前后肿瘤体积的检测
处理前后用游标卡尺测量荷瘤鼠肿瘤K(a)短(b)径,依公式肿瘤体积V=ab2/2计算出体积,比较均值。
(7)肿瘤重量的检测
荷瘤鼠颈椎脱位处死,去除皮毛,剥离皮下肿瘤,称重。
4.统计学处理
采用spss16.0软件分析结果,数据以均数士标准差表示,采用方差进行比较。
实验结果：
1.中性粒细胞纯度的鉴定
光学显微镜下,10个视野(400x)中性粒细胞所占比例平均值为90%以上。
2.冷热处理对正常小鼠中性粒细胞活性氧ROS产生水平的影响
冷热处理对正下常小鼠中性粒细胞ROS的产生水平(MFI)的检测结果为:40℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(3189.73±425.30)显著高于23℃组(296.76±72.00)(P＜0.001);4℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(5830.37±94.78)显著高于23℃组(296.76±72.00)(P＜0.001);4℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(5830.37±94.78)显著高于40℃处理组(3189.73±425.30)(P＜0.001)。
3.冷热处理对正常小鼠中性粒细胞杀伤活性的影响
冷热处理对正常小鼠中性粒细胞杀伤率检测结果为:40℃处理组中性粒细胞杀伤率(6.50±2.50%)明显高于23℃组(1.70±0.89%)(P＜0.05);4℃处理组中性粒细胞杀伤率(10.00±2.00%)明显高于23℃组(1.70±0.89%)(P＜0.05);4℃处理组中性粒细胞杀伤率(10.00±2.00%)高于40℃处理组中性粒细胞杀伤率(6.50±2.50%),但没有统计学意义。
4.冷热处理对荷瘤鼠肿瘤体积的影晌
冷热处理对荷瘤鼠肿瘤体积的影响结果为:4℃处理组肿瘤体积均值在处理后(142.52±1.41cm3)低于处理前(207.57±26.71cm3),有统计学意义(P＜0.05);40℃处理组肿瘤体积均值在处理后(143.95±33.77cm3)也低于处理前(185.72±20.97cm3),但无统计学意义,而23℃组肿瘤体积均值在处理后(260.76±86.73cm3)高于处理前(215.39±54.94cm3)。
5.冷热处理对荷瘤鼠肿瘤重量的影响
冷热处理对荷瘤鼠肿瘤重量的影响结果为:荷瘤鼠40℃处理组肿瘤重量均值(70.27±17.15mg)明显低于23℃组(116.304±14.36mg)(P＜O.05);4℃处理组肿瘤重量均值(56.27±30.12mg)明显低于23℃组(116.304±14.36mg)(P＜0.05)。
6.冷热处理对荷瘤鼠中性粒细胞ROS的影响
冷热处理对荷瘤鼠中性粒细胞活性氧ROS产生水平检测结果为:40℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(MFI)(1794.50±212.89)显著高于23℃组(1132.83±179.47)(P＜0.001);4℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(2019.97±235.46)显著高于23℃组(1132.83±179.47)(P＜0.001);4℃处理组中性粒细胞ROS平均荧光强度(2019.97±235.46)高于40℃处理组(1794.50±212.89),但无统计学意义。
7.冷热处理对荷瘤鼠中性粒细胞杀伤活性的影响
冷热处理对荷瘤鼠中性粒细胞杀伤率的检测结果为:40℃处理组中性粒细胞杀伤率(8.68±2.49%)明显高于23℃组(4.16±0.52%)(P＜0.05);4℃处理组中性粒细胞杀伤率(7.79±0.66%)明显高于对照组(4.16±0.52%)(P＜0.05)。
结论：
1.慢性冷热应激能够增强中性粒细胞的抗肿瘤作用;
2.慢性冷应激(4℃)与慢性温和热应激(40℃)对荷瘤鼠有一定治疗作用;
3.慢性冷应激(4℃)对中性粒细胞活性氧ROS产生水平的影响明显高于慢性温和热应激(40℃);
4.慢性冷应激(4℃)与慢性温和热应激(40℃)可能通过中性粒细胞产生活性氧ROS来增强其杀伤肿瘤的能力。