研究背景和目的近年动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的低龄化趋势日益受到重识,研究发现,血管内皮细胞(Vascular endothelial cell, VEC)损伤及内皮功能障碍(endothelial dysfunction, ED)是启动AS发生的早期事件。研究证实,高脂肥胖儿童已存在血管内皮损伤及动脉内膜-中层厚度改变,其血管内皮损伤和功能障碍尚属可逆性病理改变。所以,早期检测并干预血管内皮功能障碍对于预防高脂肥胖血管病变的发生、发展及改善高脂肥胖青少年的生活质量至关重要。脂质代谢紊乱是AS发生发展的独立危险因素,越来越多的证据提示氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)在引起ED与启动AS中发挥重要作用。内皮细胞对LDL,尤其oxLDL的摄取是AS的起始与进展中的最关键一步。内皮细胞摄取oxLDL后,oxLDL的脂质成份可以通过降低血管舒张功能、诱导血栓形成和炎症反应等损伤VEC及其功能。研究证实,oxLDL的内皮毒性作用主要是通过其特异性内皮细胞表面受体-植物血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1(Lectin-like oxLDL receptor-1, LOX-1)介导。oxLDL通过与LOX-1的结合,可以激活核转录因子(Nuclear Factor, NF)-κB,在转录水平上诱导内皮细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)等的表达。p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen activated p rotein kinase, p38MAPK)是丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族成员之一,通过对细胞内信号的传递参与细胞对外界刺激的调节反应,研究显示p38MAPK通路活化后,可激活NF-κB,促进内皮细胞分泌VCAM-1, E-选择素,ICAM-1,加剧中性粒细胞和单核细胞与内皮细胞黏附,启动AS。所以,减轻氧化应激、阻断oxLDL的细胞毒性作用、下调趋化因子的表达和干预组织巨噬细胞的积聚,是保护血管内皮功能,防治粥样化进展的关键所在。在AS病变的发生发展中,发生于儿童与青少年期脂质条纹形成之前的病变包括内皮功能障碍,是一可逆的过程,早期干预可逆转其向纤维斑块甚或粥样硬化斑块的进展。他汀类药物为抗AS的首选,已有大量的相关研究,且本课题组已应用他汀类药物干预治疗,本课题选用具有独特而全面的降脂作用的烟酸作为研究对象。20世纪60年代,烟酸即开始应用于临床的降脂治疗,半个世纪过去了,美国心脏病学会(AHA)2004年仍将其列为《心血管疾病防治指南》的推荐药物之一,我国新近出台的《中国成人血脂异常防治指南》也将烟酸列为一线降脂药物之一。近年临床实验表明,烟酸除调脂作用外,还具有抗炎、增强LDL抗氧化能力的作用,已有研究显示烟酸可以改善血管内皮功能,阻止AS的进展,但其改善内皮功能障碍的确切机制尚不十分清楚。本研究旨在探讨烟酸对于oxLDL/LOX-1系统及p38MAPK/NF-KB信号通路介导的血管内皮功能障碍的干预效果及其可能机制。本研究内容分为两部分：第一部分通过建立高脂饮食诱导高脂肥胖大鼠模型,并给予烟酸干预,在体研究oxLDL/LOX-1系统在血管内皮功能障碍中的作用,观察烟酸干预对血管内皮的保护作用；第二部分通过体外应用溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine, LPC)培育人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)建立模型,并给予烟酸干预,体外观察p38-MAPK/NF-KB信号通路在血管内皮功能障碍中的作用,同时观察烟酸干预对血管内皮细胞的保护作用与可能机制。研究方法1.在体动物实验1.1高脂肥胖大鼠模型的建立及分组：21日龄断乳雄性Wistar大鼠30只,体重65～75g,随机分为对照组、高脂组和烟酸组,每组10只。其中对照组(CG),予以常规商用鼠饲料；高脂组(HF),予以高脂饲料(包括10%猪油、2%胆固醇)；烟酸组(DG),予以上述高脂饲料并烟酸缓释片100mg/(kg-d),采用管饲法,共喂养12周。整个实验期间所有大鼠均自由饮水,各组每周称量体重三次,于实验12周末,分别随机处死8只大鼠取材和检测。1.2检测指标及方法1.2.1体重和身长：各组每周测量三次体重和身长。1.2.2外周血指标的检测：外周血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平采用全自动生化分析仪检测；血清可溶性ICAM-1(sICAM-1)、oxLDL水平采用ELISA方法检测；血清NO水平采用硝酸还原酶比色法检测；血浆内皮素(endothelin, ET)含量采用放射免疫法检测。1.2.3血管内皮超微结构观察：胸主动脉组织依次经戊二醛、锇酸固定、脱水、包埋,甲苯胺兰超薄切片后行透射电镜铀一铅双重染色,观察主动脉血管内皮细胞超微结构的改变。1.2.4主动脉壁LOX-1、ICAM-1蛋白表达：冰冻切片免疫荧光染色法定性检测胸主动脉血管壁LOX-1蛋白的表达；石蜡切片免疫组化SP法检测胸主动脉血管壁ICAM-1蛋白的表达。1.2.5 Western blot方法定量分析主动脉壁LOX-1、ICAM-1蛋白含量：提取主动脉组织标本的蛋白质样品,经变性、电泳、转膜及封闭后,先后加入稀释的LOX-1、ICAM-1一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育,经ECL显影、凝胶成像分析系统扫描蛋白条带进行光密度分析。以Β-actin作为内参,以目的蛋白/B-actin蛋白条带吸光度值作为蛋白表达强度。1.2.6逆转录—聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测主动脉血管壁LOX-1、ICAM-1 mRNA的表达水平：提取各组主动脉总RNA,将mRNA逆转录成cDNA后行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、成像分析。分别以LOX-1、ICAM-1与Β-actin扩增条带吸光度比值作为其：mRNA表达强度。2.体外细胞试验2.1人脐静脉内皮细胞模型(HUVECs)的建立与分组：人脐静脉内皮细胞株,用Medium200培养基(内含低血清生长增补剂LSGS)在37℃、5%CO2条件培养箱中培养,用0.125%胰蛋白酶进行消化、传代。内皮细胞呈多角形,单层铺路石状紧密排列。2%台盼蓝染色判断细胞活性,活细胞数占细胞总数96%以上,用于实验。实验分组：(1)阴性对照组：培养基；(2)LPC不同作用时间组：培养基加入终浓度为20μmol/L的LPC,分别培养0、10、30、60 min及4、8h；(3)烟酸(niacin)不同剂量与10μmol/L的p38-MAPK的抑制剂(SB203580)组：培养基中分别加入终浓度为0、0.25、0.5、1mmol/L的烟酸培养18h, SB203580 10μmol/L培养1h,再分别加入LPC培养8h及24h。各组细胞浓度为5×105／ml,接种于6孔板,每孔1ml。2.2检测指标及方法2.2.1 Western blot方法定量分析内皮细胞pp38-MAPK、p38-MAPK、ICAM-1蛋白含量：方法同1.2.5。2.2.2逆转录—聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA表达：方法同1.2.6。2.2.3实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction, Real-time PCR)法检测内皮细胞ICAM-1基因的表达：提取内皮细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA后,在PRISM 7700全自动实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃15 s,60℃1min,共40个循环。定量分析根据ABI user manual the comparative method计算基因表达相对量,基因表达β-actin标准化公式：ΔCT= CT target-CT refernce,基因表达的不同的信号：ΔΔCt=ΔCt (gene of LPS treated group)-ΔCt (gene of untreated group),基因表达的相对倍数：2-△△CT。2.2.4细胞免疫荧光方法检测LPC诱导的ICAM-1、NF-κB蛋白表达：将载玻片在使用之前灭菌,一次灭菌并贮存在无菌状态下。用PBS洗涤细胞(400×g离心5min),并重悬于PBS中。调整浓度至1×106／ml；将载玻片固定于甩片机的转头上,然后加入0.1ml细胞悬液；迅速使离心力达到1200×g,离心5～10min；使玻片上单层细胞在空气中干燥15-20min。4%多聚甲醛室温固定15min, 1×PBS洗3次,每次10min,0.2%Triton X—100透化5min,洗涤。1%BSA室温封闭1h。加1：200一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里,4度过夜。洗涤,加1:200FITC-二抗(用1%BSA稀释)1h,避光。洗涤,95%甘油封片,荧光显微镜下观察。3.统计分析：采计量资料采用nean±D表示,统计学处理均采用SPSS16.0软件进行分析。各组之间的差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两之间比较采用LSD检验,相关分析采用Pearson检验,P<0.05认为差异有统计学意义。研究结果1.在体研究结果1.1一般情况及Lee指数的变化：整个实验期间,高脂组大鼠死亡一只,死亡原因为严重高血脂合并感染。高脂组与烟酸组大鼠体重明显高于对照组(P<0.01),高脂组与对照组比较,Lee指数升高,差异有统计学意义(P<0.01),而烟酸组Lee指数介于高脂组与对照组之间,但与高脂组比较无统计学差异。1.2血脂水平的变化：高脂组外周血TG、TC、LDL平均显著高于对照组,HDL低于对照组。与高脂组比较,烟酸组TG、TC、LDL、oxLDL水平均显著降低(P<0.01),且HDL高于高脂组(P<0.01),差异有统计学意义。1.3外周血内皮分泌功能指标的变化：高脂组外周血ET、sICAM-1水平均高于对照组(P<0.01),NO低于对照组(P<0.01)。烟酸组ET、sICAM-1水平均低于高脂组(P<0.01),NO高于高脂组(P<0.01),差异有统计学意义,其中NO、sICAM-1已达对照组水平。1.4主动脉血管内皮细胞超微结构的变化：正常大鼠主动脉内膜表面平整,内皮细胞扁平状,排列规则,细胞器形态数量正常,胞核规则；高脂饮食12周时内皮超微结构变化明显,内皮细胞肿大,脂质沉积,内皮细胞坏死、溶解,部分或大面积与基底膜脱离或脱落。1.5主动脉血管壁LOX-1蛋白的表达：1.5.1免疫荧光染色法定性检测主动脉血管壁LOX-1蛋白的组织表达：对照组大鼠主动脉血管壁基本未见或极少LOX-1蛋白的阳性表达(亮绿色荧光染色),而12周时高脂肥胖大鼠主动脉内皮层可见明显的亮绿色荧光染色信号；烟酸组大鼠主动脉内皮层的亮绿色荧光染色信号明显减弱。1.5.2 Western Blot定量分析主动脉血管壁LOX-1蛋白表达量：ECL显影结果及以B-actin蛋白表达为参照,图像系统定量分析结果显示,各组腹主动脉壁LOX-1在蛋白水平上均有表达,对照组LOX-1蛋白表达水平极低,而12周时高脂肥胖大鼠LOX-1蛋白表达水平明显高于正常对照组(P<0.01)；烟酸组LOX-1蛋白表达水平明显降低,同高脂组比较差异明显(P<0.01)。1.6主动脉血管壁ICAM-1蛋白的表达水平：1.6.1免疫组织化学SP法检测主动脉壁ICAM-1蛋白表达：ICAM-1主要表达于大鼠主动脉血管内皮层细胞。对照组ICAM-1蛋白阳性表达极少,只有少数内皮细胞胞浆内有淡染的颗粒；高脂组内皮层可见连续、浓染棕色颗粒;烟酸组,内皮细胞ICAM-1蛋白阳性表达明显减弱。1.6.2 Western Blot定量分析主动脉血管壁ICAM-1蛋白表达量：ECL显影结果及以B-actin蛋白表达为参照,图像系统定量分析结果显示,各组主动脉壁ICAM-1在蛋白水平上均有表达,对照组ICAM-1蛋白表达水平极低,而12周时高脂肥胖大鼠ICAM-1蛋白表达水平明显高于正常对照组(P<0.01)；烟酸组ICAM-1蛋白表达水平明显降低,同高脂组比较差异明显(P<0.01)。1.7 RT-PCR定量检测主动脉血管壁LOX-1, ICAM-1 mRNA表达水平：对照组大鼠主动脉血管壁LOX-1、ICAM-1 mRNA表达极微弱；12周时,高脂组LOX-1、ICAM-1 mRNA表达明显增强,表达水平明显高于对照组(P<0.01)；同高脂组比较,烟酸组LOX-1、ICAM-1 mRNA在主动脉壁的表达均明显受抑制(P<0.01)。1.8相关性分析：高脂肥胖大鼠血清oxLDL与NO、HDL水平呈负相关,与血浆ET、血清sICAM-1水平正相关；Pearson相关分析显示,以上相关性仍具有统计学意义。同时,主动脉血管壁LOX-1 mRNA表达水平与血清oxLDL水平及ICAM-1 mRNA表达水平亦显著正相关,与NO呈负相关。2.体外研究结果2.1烟酸与p38MAPK阻滞剂(SB203580)对LPC诱导的ICAM-1蛋白表达的影响：2.1.1 Western blot定量分析：与对照组比较,LPC24h组可显著增力(?)ICAM-1蛋白的表达(P<0.01),而烟酸、SB203580干预组ICAM-1蛋白的表达水平明显降低,同LPC组比较有统计学意义(P<0.01)。2.1.2细胞免疫荧光染色：对照组细胞基本未见阳性荧光染色信号；LPC组细胞可见明显的亮绿色荧光信号；而烟酸、SB203580干预组,细胞仅见较弱的绿色荧光信号。2.2烟酸与p38MAPK阻滞剂(SB203580)对LPC诱导的ICAM-1 mRNA表达的影响：RT-PCR与Real-time PCR分析：与对照组比较,LPC4h组及LPC8h组均可显著增加ICAM-1 mRNA的表达(P<0.01),而烟酸干预组ICAM-1的表达水平明显降低,同LPC8h组比较有统计学意义(P<0.01),且呈浓度依赖性；而SB203580组未能降低ICAM-1 mRNA的表达(P>0.01)。2.3 Western Blot检测LPC诱导的p38-MAPK的活性：结果显示在培养10min时达到最高峰,60min时减退；给予不同浓度的烟酸及10μmol/L的SB203580干预后,烟酸和SB203580均能降低p38-MAPK的活性,而对p38-MAPK本身无影响。2.4不同干预方法对HUVECs NF-KBp65蛋白表达的影响：2.4.1 Western Blot定量检测结果：与对照组比较,LPC可显著增加NF-KBp65蛋白的表达(P<0.01),而烟酸干预组NF-KBp65蛋白的表达水平明显降低,同LPC组比较有统计学意义(P<0.01)。2.4.2细胞免疫荧光染色：对照组阳性染色细胞较少,未见明显核染色细胞,而LPC24h组内皮细胞胞浆内可见明显亮绿色深染颗粒,亦可见较多细胞核染色；烟酸干预组绿染细胞数和染色强度均明显减少、减弱,仅有极少细胞胞核染色；SB203580干预组内皮细胞胞浆内仍可见明显亮绿色深染颗粒。研究结论1.高脂肥胖早期即可出现血管内皮功能和超微结构的损伤以及过强的LDL氧化修饰；外周血NO、ET、sICAM-1和oxLDL水平可作为内皮功能障碍的早期筛查指标。2.高脂肥胖早期血管内皮功能损伤,同步发生了主动脉血管壁LOX-1蛋白和基因表达上调,且与血清oxLDL水平密切相关,提示oxLDL/LOX-1系统是诱导高脂肥胖早期血管内皮功能障碍的重要分子因素。3.烟酸干预不仅可改善血管内皮功能,还可降低血清oxLDL水平,明显下调使主动脉血管内皮LOX-1的表达；提示烟酸可能通过下调oxLDL/LOX-1系统从而发挥改善血管内皮功能的作用。4.在LPC诱导的HUVECs中,ICAM-1的蛋白与：mRNA的表达均明显增强,p38-MAPK的活性及NF-KBp65表达亦明显增强。烟酸干预可降低上述各项表达,但p38-MAPK的抑制剂SB203580只能降低ICAM-1的蛋白的表达,而不能影响其mRNA及NF-KBp65的表达,提示烟酸可能一方面通过干预p38-MAPK的活性调节ICAM-1的蛋白表达,另一方面通过抑制其他通路干预NF-KBp65,调节ICAM-1的mRNA表达。烟酸这种内皮保护作用至少部分与抑制(?)p38MAPK/NF-KB系统所介导的内皮损伤作用有关。创新和意义1.体外研究发现oxLDL的主要成分LPC诱导的HUVECs中,ICAM-1的蛋白与p38-MAPK的活性同步增强,应用p38-MAPK抑制剂则降低ICAM-1蛋白表达,而对ICAM-1 mRNA及NF-κB的表达无影响；ICAM-1 mRNA与NF-κB始终表达同步。因此,本研究首次体内外相结合证实,oxLDL可通过与LOX-1结合,激活p38MAPK/NF-KB两条通路,介导高脂肥胖血管内皮损伤。2.首次体内体外对比研究发现,烟酸可减轻高脂肥胖血管内皮细胞功能的损伤,并同步降低oxLDL及LOX-1、p-p38MAPK、NF-κB、ICAM-1蛋白和基因表达,提示烟酸的血管内皮保护作用与其抗氧化、抑制p38MAPK活性和降低NF-κB的表达有关。此为早期防治高脂肥胖血管病变拓展新的思路。