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为了开辟治疗苯丙酮尿(PKU)症治疗的新途径,本实验室在既往的几年里已成功地建立了能高效表达水稻苯丙氨酸氨解酶(PAL)的大肠杆菌工程菌株BL21DE3pET28crPAL-1-cDNA,经检测该工程菌诱导表达粗提物表达有PAL蛋白,并具有PAL活性,可在体外降解苯丙氨酸,用于制造无或低苯丙氨酸食品,或制成人工微胶囊,口服后在肠道中消除食物消化后产生的苯丙氨酸,防止高苯丙氨酸血症的发生,用于苯丙酮尿症的非饮食治疗。能否将该工程菌诱导表达粗提物应用于临床,尚需深入一步对其进行遗传毒理学方面的研究。 按照人用药品安全性毒理学评价标准,在考虑原核细胞和真核细胞、体内与体外试验、生殖细胞与体细胞相结合原则的基础上,结合本实验室已有的遗传毒基础和试验条件,本研究采用了Ames试验、双核微核试验、单细胞凝胶电泳的方法,对BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA、BL21DE3pET28c的诱导表达粗提物及苯丙氨酸的酶解产物苯丙烯酸(CINN)进行遗传毒理学检测。 Ames试验采用经典的平板掺入法,在加与不加体外活化系统条什下,CINN各浓度组在各受试菌的回变率均无增加,高浓度时尚有降低,可能为高浓度苯丙烯酸具有抑制细菌生长及抑制细菌自发突变率作用,证实其无致突变作用。BL21DE3pET28c-rPAL-1-cDNA、BL21DE3pET28c的诱导表达粗提物在加与不加体外活化系统,回变菌落数与阴性对照相比均有增加,且在某一浓度组时,是自发突变率2倍以上,存在剂量-效应关系,显示出具有直/间接致突变性。 在FL细胞体外双核微核试验中,苯丙烯酸各浓度组在直/间接实验设计中,均未引起微核率增高。而BL21DE3pET28crPAL-1-cDNA、BL21DE3pET28c的诱导表达粗提物,在间接实验设计中,微核细胞率较阴性对照有明显增高,应用Lowry法蛋白定量,浓度在0.smghl时,P值分别<(刀 1和 0刀5,并存在剂量-效应关系,显示有间接致染色体损伤作用;在直接实验设计中,未发现类似现象。 FL细胞体外单细胞凝胶电泳,苯丙烯酸各浓度组在W间接实验设计中,未引起拖尾率升高及尾长拖长。BLZIDE3P———肌’“”“、BLZIDE3——“诱导表达粗提物,在直l间接实验设计中,拖尾细胞率、尾长均较阴性对照组明显增高和延长,在LOeq法蛋白定量浓度达0.05mghl时,增高即有统计学意义,P<0.05,0.of,并存在剂量-效应关系,显示出BLZI DE3。”’c-r”‘’·c””“、BLZIDE3。”’“诱导表达粗提物有直/间接致DNA损伤作用。 根据 LOWry法蛋白定量同浓度试验组,转化空载体的工程菌 BLZI DE3Pm’“和能表达PAL的工程菌BLZIDE3。””c-。”‘-‘”””“诱导表达产物有类似的致突变作用,它们之间无显著差别,认为粗提物中的诱变成分,存在于该原核表达体系之中,而非PAL本身。至于PAL的遗传毒性尚需纯化后进一步试验证明。