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膜蛋白是生物膜功能的主要承担者,是细胞与细胞以及细胞与周质环境进行信息交流、物质交换的主要媒介,在代谢、免疫、激素调节、酶催化等多种生理活动中均发挥至关重要的作用。但是鉴于膜蛋白极强的疏水性以及复杂的磷脂双分子层环境,长期以来关于各类膜蛋白的体外重构、结构解析、功能研究较水溶性蛋白都更为困难。本论文针对两类家族的膜蛋白(线粒体载体蛋白和病毒离子通道)主要开展了三部分的工作:第一部分主要是研究PC去垢剂中ATP/ADP转运蛋白(AAC)与心磷脂的特异性结合;第二部分是关于长链脂肪酸(FA)激活人源线粒体解耦联蛋白1(UCP1)的分子机制的研究;第三部分是对抑制剂小分子HMA与丙型肝炎病毒离子通道p7的特异性结合。 第一部分工作:体外用来稳定膜蛋白的体系绝大多数是由去垢剂组成的微团。溶液核磁技术在研究膜蛋白结构与功能时最常用的当属PC类去垢剂,它由于构成的微团体积较小,双电荷的亲水头部等优势使得膜蛋白-去垢剂复合体即使在很高浓度下依然可以保持均一性较好、浓度较高的状态。但是有人认为由于它的亲水头部较强的电荷基团,容易与膜蛋白基质端的氨基酸发生电荷相互作用从而影响膜蛋白真正的结构特征与功能。因此,在本课题中,我们选用研究成熟透彻的ADP/ATP转运蛋白AAC,将其重构到DPC去垢剂微团中。前期实验已经证明线粒体内膜中特异性存在的心磷脂(CL),对AAC的功能起到关键的调节作用,并且在AAC晶体结构中可以清楚看到心磷脂磷酸头部的结合位点。我们通过NOE结合分子动力学模拟的方法发现,在DPC微团中,AAC同样可以特异性的结合心磷脂,并且结合模式与比例和在DDM中的晶体结合模式高度一致。这说明PC去垢剂虽然电荷相对较强,但并不影响膜蛋白结构的完整性,在此体系中获得的膜蛋白功能信息也是具有指导意义的。 第二部分工作:线粒体解偶联蛋白1(UCP1)广泛存在于棕色脂肪组织中,介导哺乳动物体内非战栗产热,与ATP合成解偶联,消除质子浓度梯度,同时释放大量热能,因此是治疗肥胖的一个重要的靶点蛋白。UCP1转运质子的过程可以被长链脂肪酸(FA)激活,但由于没有相关证据证明FA与UCP1的直接相互作用,所以激活机制长期以来众说纷纭。本课题中,我们运用化学位移干扰以及顺磁驰豫共振的方法,找到了长链脂肪酸C16FA在UCP1蛋白中的结合位点,FA特异性地将疏水长链锚定在跨膜螺旋H1和H6中间的脂膜侧口袋中,亲水酸性头部靠近蛋白通道基质端的碱性氨基酸K56、K269。而在体外脂质体功能实验中,我们将K56、K269及周边的碱性氨基酸突变,发现蛋白转运质子的活性显著下降。说明这两个位置的氨基酸对于FA的结合起到关键作用,并且FA这种紧贴UCP1蛋白周质侧的结合模式与之前提出的翻转模型中的结合模式非常吻合,这对揭示UCP1介导的产热转运机制提供了很好的理论基础。 第三部分工作:丙型肝炎病毒会引发慢性肝炎、肝硬化甚至导致肝癌,严重威胁人类健康。p7是丙型肝炎病毒基因组编码的唯一一个病毒离子通道,活性可以被金刚烷胺、HMA以及长链氨基糖衍生物抑制,因此p7一直是治疗丙型肝炎的靶点蛋白。本课题我们采用溶液核磁技术,借助分子动力学模拟,成功找到HMA在p7蛋白通道中的结合位点。与之前发现的金刚烷乙胺结合位点不同,HMA结合于p7变构效应更为剧烈的顶端活性区,但是却能引起与金刚烷乙胺相同的别构调节效应,使p7两端控制开关的氨基酸的化学位移引起强烈变化。这对未来以HMA和金刚烷胺分子结构为基础,设计更为有效的靶点药物起到一定的指导作用。 除此之外,第四部分主要总结了溶液核磁技术近年来在膜蛋白研究领域的应用,包括解析蛋白结构、研究蛋白动力学变化、研究蛋白与配体相互作用以及新开发的核磁应用手段等四个方面。