急性心肌梗死是当代严重危害人类生命与健康的疾病之一。虽然临床上通过药物溶栓或介入治疗可使梗死心肌恢复血液再灌注,却会造成类似于炎症的心肌缺血再灌注(Ischemia Reperfusion Injury,I/R)损伤,加重组织结构和功能破坏。因此,如何减轻心肌缺血后的再灌注损伤成为目前研究的热点。然而,引起心肌缺血再灌注损伤的机制十分复杂,大量动物实验研究表明心肌I/R损伤产生的机制与钙超载、中性粒细胞浸润、血管紧张素、氧自由基以及一氧化氮产生等有关。心肌I/R损伤是由能量代谢异常引起的一系列连锁反应,其中氧自由基的产生是引起早期心肌细胞损伤的主要原因之一。过多的氧自由基能够与蛋白质、脂类以及核酸等生物大分子发生反应,引起大分子变性、生物膜损伤以及脂质过氧化,造成心肌细胞结构和功能受损,最终引起细胞凋亡。研究表明来源于心肌线粒体过多的ROS会通过诱导NLRP3,招募凋亡相关斑点状蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)并激活Caspase-1,而Caspase-1在炎症性凋亡的发生发展过程中扮演着重要角色。曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种广谱的组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase,HDAC)抑制剂,能够提高组蛋白乙酰化水平,目前广泛用作抗肿瘤的实验研究。我们课题组前期研究证明TSA可以减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,但具体机制还有待于进一步探讨。Fox O(Forkhead box O transcription factors)作为叉头蛋白家族的一员在新陈代谢、细胞存活及对抗氧化应激反应等过程中起重要作用。作为Fox O蛋白家族的成员之一,Fox O3a可以通过对抗氧化应激的机制减轻小鼠心肌损伤,但其在体大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用尚未见报道。研究表明,在糖尿病心肌病模型中,Mir-30d可以通过抑制Fox O3a和抗凋亡蛋白ARC的表达,上调caspase-1而诱导炎症性凋亡。而在肾细胞中,内源性HDAC抑制剂β-OHB通过抑制HDAC1活性,升高FOXO3a启动子区域组蛋白乙酰化水平,促进FOXO3a转录进而减轻氧化应激损伤。我们推测Fox O3a可能在TSA减轻心肌缺血再灌注损伤的作用中扮演重要角色,并且Fox O3a可能参与心肌I/R损伤后炎症性凋亡的调控。为了验证我们的推测,我们进行了如下实验:1.大鼠心肌缺血再灌注损伤中伴有炎症性凋亡的产生我们分别进行了体内和体外实验。采用结扎及松开冠状动脉的左前降支方法制备大鼠心肌I/R损伤模型,采用免疫组织化学方法检测了大鼠心肌组织炎症性凋亡关键蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达变化。结果显示,与假手术组比较,I/R组心肌组织炎症性凋亡关键蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达显著升高,表明I/R损伤可能会诱发大鼠心肌产生炎症性凋亡。同时我们检测了再灌注损伤大鼠心肌组织ROS的表达情况,结果显示,与Sham组比较,I/R组大鼠心肌组织中ROS的表达明显增加,初步验证大鼠I/R可能通过增加心肌组织ROS引发炎症性凋亡。随后我们选取H9c2大鼠心肌细胞系,采用H2O2建立体外氧化应激损伤模型,进一步观察是否氧化应激损伤导致ROS增多会导致心肌产生炎症性凋亡。我们采用CCK-8法检测H9c2大鼠心肌细胞的存活率筛选出H2O2引起H9c2细胞氧化应激损伤较为稳定的最适浓度。另外,我们采用ROS试剂盒检测了不同时间点ROS的表达变化,采用免疫荧光法检测了炎症性凋亡关键蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达变化,发现与空白对照组相比,H2O2处理组炎症相关蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达量显著增加,表明氧化应激可能引起H9c2细胞产生炎症性凋亡。2.TSA减轻大鼠心肌氧化应激引起的炎症性凋亡第一部分我们通过体内外实验初步验证了大鼠心肌缺血再灌注损伤可能通过增加ROS引发炎症性凋亡,为了明确TSA是否能够通过影响大鼠I/R损伤引发氧化应激诱导的炎症性凋亡,发挥对再灌注后的心肌保护作用,我们进行了如下实验:(1)TSA对I/R损伤的大鼠心肌损伤的影响:为了验证TSA对I/R损伤大鼠的影响,我们采用TTC法测定了I/R损伤后大鼠的心肌梗死面积,通过试剂盒检测了大鼠血清心肌酶活性,HE染色对大鼠心肌组织进行形态学观察,结果显示,TSA可以减少大鼠心肌梗死面积,降低血清心肌酶的活性,改善大鼠心肌的组织形态,从而减轻大鼠I/R损伤。(2)TSA对I/R损伤大鼠氧化应激的影响:我们采用流式细胞术检测大鼠心肌组织ROS的水平,结果显示TSA干预的I/R大鼠心肌组织ROS的水平明显降低。采用SOD和MDA试剂盒检测了大鼠心肌组织SOD的活性和MDA的含量,结果显示TSA干预的I/R大鼠心肌组织SOD活性增加、MDA含量降低。(3)TSA能否影响大鼠I/R损伤诱导的炎症性凋亡:我们首先采用流式细胞术初步观察TSA对I/R损伤大鼠心肌细胞凋亡的影响,结果表明TSA干预组较I/R组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低。随后采用免组化及Western blot方法观察了TSA对I/R损伤大鼠炎症性凋亡关键蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18表达的影响,结果表明TSA可明显降低I/R损伤大鼠心肌组织Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达。(4)TSA对I/R损伤大鼠血清炎症相关因子的影响:炎症性凋亡发生发展过程中伴有大量促炎症因子的释放,为了验证TSA是否会影响炎症性凋亡过程中炎症因子表达,我们采用ELISA方法对血清炎症相关因子进行了检测。结果显示TSA干预组大鼠血清炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-18及IL-1β的表达明显低于I/R组大鼠。3.Fox O3a是TSA干预氧化应激诱导大鼠心肌炎症性凋亡的关键分子。研究表明Fox O3a通过对抗氧化应激减轻小鼠心肌损伤,并且内源性HDAC抑制剂β-羟基丁酸能增加Fox O3a启动子区乙酰化对抗HEK293细胞的氧化应激反应。为了明确TSA是否与通过Fox O3a改善心肌损伤,我们采用体内外实验进行了如下研究:(1)TSA对氧化应激损伤大鼠Fox O3a表达的影响:首先我们采用Western blot方法检测I/R损伤大鼠及H2O2作用H9c2细胞不同时间点Fox O3a蛋白表达的变化,结果显示再灌注6h、12h和24h后,Fox O3a的表达呈时间依赖性下降,且再灌注24h下降尤为显著;H2O2作用H9c2细胞不同时间点Fox O3a表达也逐渐下降,且在400μM H2O2处理2h后显著下降。接下来我们采用Western blot方法检测了TSA对再灌注24h大鼠Fox O3a表达的影响,结果表明,0.2 mg·kg-1 TSA可明显增加I/R损伤大鼠Fox O3a的表达。免疫荧光及Western blot结果显示TSA可增加H2O2诱导的H9c2细胞Fox O3a的表达。(2)TSA对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响:我们采用DCFH-DA荧光探针,检测ROS的水平,采用JC-1染色法,检测线粒体膜电势,采用Western blot方法观察TSA对SOD2和Catalase表达的影响。结果表明TSA处理组ROS及线粒体膜电势下降,SOD2和Catalase的表达量明显升高,提示TSA能够减轻氧化应激损伤。(3)TSA对H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞炎症性凋亡的影响:为了初步探讨TSA对H2O2诱导的大鼠H9c2心肌细胞炎症性凋亡的影响,我们采用Annexin V-FITC/PI方法检测了心肌细胞凋亡率,采用Western blot方法观察了炎症性凋亡关键蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达,结果显示,TSA干预组大鼠心肌H9c2细胞凋亡率明显降低,Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达亦明显降低,提示TSA能减轻H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞炎症性凋亡。(4)TSA对H2O2诱导的大鼠心肌H9c2细胞炎症相关因子分泌的影响:为了验证TSA是否会影响炎症性凋亡过程中炎症因子发达的变化,我们采用ELISA法检测了大鼠心肌H9c2细胞培养基中炎症相关因子的表达,结果表明TSA干预组大鼠心肌H9c2细胞培养基中炎症相关因子TNF-α、IL-6、IL-18及IL-1β的表达明显低于H2O2组,提示TSA能够降低炎性因子的分泌。(5)TSA基于Fox O3a干预氧化应激介导大鼠心肌炎症性凋亡:我们利用RNA干扰技术敲低大鼠H9c2心肌细胞内的Fox O3a,在确保转染效率的前提下,Fox O3a si RNA能够有效抑制Fox O3a基因及蛋白的表达。同时,H2O2及TSA处理组的catalase和SOD2也明显受到抑制;而H2O2及TSA处理组的炎症性凋亡相关蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达则明显增加,提示TSA可能基于Fox O3a干预氧化应激介导的大鼠心肌炎症性凋亡。4.TSA调控Fox O3a表达的机制研究第三部分的实验中,我们初步验证TSA可能基于Fox O3a干预氧化应激介导的大鼠心肌炎症性凋亡,但TSA又是如何对Fox O3a进行调控的呢,我们进行了如下实验:(1)Ⅰ类HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)与心血管疾病发生发展密切相关,因此我们采用HDAC活性试剂盒通过比色法对它们进行检测,结果显示,与control组相比,H2O2组H9c2细胞Ⅰ类HDACs的活性明显增加,TSA干预组Ⅰ类HDACs的活性明显降低。提示氧化应激损伤可能导致H9c2细胞中Ⅰ类HDACs活性升高,TSA可以有效降低H2O2诱导的H9c2细胞Ⅰ类HDACs的活性。(2)TSA对Fox O3a基因启动子区H3及H4组蛋白乙酰化修饰的影响:为了验证TSA是否通过改变基因启动子区组蛋白的乙酰化水平影响Fox O3a基因转录,我们采用Ch IP方法检测了TSA处理后Fox O3a基因启动子区H3、H4乙酰化水平,结果显示TSA干预组Fox O3a基因启动子区的组蛋白H4乙酰化程度显著升高,而组蛋白H3的乙酰化程度没有明显变化,说明TSA可能通过改变了Fox O3a基因启动子区组蛋白H4的乙酰化程度进而影响Fox O3a的基因转录。通过上述实验,我们得出如下结论:1.大鼠心肌氧化应激损伤可引起炎症性凋亡。2.TSA可以减轻大鼠心肌氧化应激引起的炎症性凋亡。3.Fox O3a是TSA干预氧化应激诱导大鼠心肌炎症性凋亡的关键分子。4.TSA通过改变Fox O3a基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平影响Fox O3a的表达。综上所述,曲古菌素A基于Fox O3a干预氧化应激介导的大鼠心肌炎症性凋亡。