论文部分内容阅读
肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的首要因素,统计数据显示,九成以上的肿瘤患者死于肿瘤转移而不是原发性肿瘤。肿瘤转移的程度与电压门控钠离子通道的表达有关,肿瘤细胞的迁移和转移受钠通道(尤其是Na_v1.7亚型)激活或者抑制的影响。研究表明Na_v1.7在高转移性前列腺癌Mat-LyLu细胞上特异性高表达,并促进其转移活性,但分子机制尚不清楚。磷酸化修饰和互作蛋白是钠通道功能执行和调控的必要途径:一方面磷酸化修饰在细胞信号转导过程中发挥重要作用,在Na_v1.7活性受到影响时,其磷酸化修饰会出现动态变化;另一方面,Na_v1.7活性的改变可以通过与不同类型的蛋白质发生互作来行使功能。阐明在Mat-LyLu细胞转移过程中Na_v1.7互作蛋白和磷酸化修饰能够为Na_v1.7调节Mat-LyLu细胞转移的分子机制提供理论基础。因此,第一部分,我们利用两种作用于Na_v1.7的多肽毒素JZTX-I和HNTX-III处理大鼠前列腺癌Mat-LyLu细胞,结合iTRAQ标记与TiO2富集,通过LC-MS/MS质谱鉴定比较JZTX-I处理组(转移增强组)、Control组(对照组)和HNTX-Ⅲ处理组(转移减弱组)中的差异磷酸化蛋白质。我们一共鉴定到1919条非冗余磷酸化肽段,包含3519个磷酸化位点,在657个非冗余磷酸化蛋白质上。在至少两个iTRAQ平行组中都鉴定到的磷酸化蛋白质有446个(对应1106条磷酸化肽段,将这一组记为iTRAQ-O),这些蛋白主要参与细胞生理进程和代谢,行使各种分子结合以及转录共激活活性功能。通过在线motif-X软件对iTRAQ-O组1106条磷酸化肽段进行了基于序列的motif富集分析,一共发现13种丝氨酸motif序列、4种苏氨酸motif序列及1种酪氨酸motif序列。我们收集了iTRAQ-O组中446个overlap磷酸化蛋白质的定量信息,得到每个磷酸化蛋白质114/116和115/116这两项比值,通过将比值≤0.67及比值≥1.5作为阈值共得到120个差异磷酸化蛋白质,将这些蛋白分成七组进行了相关生物信息学分析,并从中找出与肿瘤转移相关的差异磷酸化蛋白质,通过STRING软件分析了其蛋白-蛋白相互作用网络。第二部分,我们利用Na_v1.7的激活剂藜芦碱处理Mat-LyLu细胞,提取质膜,结合双向电泳和质谱鉴定,一共获得29个差异表达蛋白质点,其中,与对照组相比,藜芦碱处理组中表达下调的蛋白有28个,表达上调的蛋白有1个。在29个差异表达蛋白质点中,我们通过功能注释分析,得到了与肿瘤转移相关的4个蛋白质:Tonsoku-like protein(TONSL)、Annexin A2(Anxa2)、Keratin,type II cytoskeletal6A(Krt6a)、Beta-defensin 33(Defb33)。