论文部分内容阅读
胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一,其年龄标化发病率和死亡率均居我国常见恶性肿瘤之首。由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性临床症状,胃癌的总体五年生存率约30%。胃癌化疗产生的抗药性和药物毒性反应是中晚期患者治疗失败的主要原因。RegⅠα(regenerative gene I a)属再生基因家族,在人体中主要分布于胰腺和胃粘膜中,由166个氨基酸组成的含信号肽的蛋白质。研究显示RegⅠα蛋白对胃黏膜细胞具有促进增殖和抗凋亡作用,在胃癌细胞中呈过度表达,并与胃癌的T分期,分化程度,淋巴结转移以及患者的总体生存率有关。因此认为,RegⅠα基因表达异常与胃癌发生发展密切相关,是潜在的生物治疗靶向基因。2002年小RNA干扰技术被视为重大科学突破,它能在转录后水平特异性沉默某个基因表达。此技术被广泛应用于各类癌症研究中,但对胃癌RegⅠα基因的作用及其机制的报道很少。本研究以RegⅠα基因为靶标,构建小RNA干扰质粒,转染RegⅠα基因高表达胃癌细胞,通过细胞和分子生物实验观察其对胃癌细胞株RegⅠα干扰作用及细胞生物学行为的影响,探讨利用小RNA干扰技术进行胃癌基因治疗的可能性。首先采用RT-PCR去检测6株胃癌细胞Reglα基因mRNA表达水平,结果显示：MKN45和AGS胃癌细胞株高表达RegⅠαmRNA。随后根据RNAi设计原则,寻找靶序列两条,合成shRNA的DNA模板单链,包括siRNA的正义链和反义链。模板链两端设计BamHI, ALF-II酶切位点,载体标记基因GFP(绿色荧光蛋白),阴性对照为空载体。于体外构建RegⅠα基因小RNA干扰的重组质粒后,将带有RegⅠαRNAi表达载体和空载体的DH5α大肠杆菌在LP Amp培养基上涂板,37℃培养过夜,挑取单克隆菌落,37℃摇菌过夜,18小时后抽提纯化质粒。紫外分光光度仪检测OD值,λ-HindⅢ观察质粒纯度。重组质粒双酶切进行琼脂糖电泳验证,并送南京金思特公司检测核苷酸序列。获得RegⅠαRNAi质粒和空载体质粒后,对RegⅠα高表达细胞株MKN45和AGS进行稳定转染。转染前1天,将对数生长期的人胃癌MKN45和AGS细胞以每孔1×105／孔接种于6孔培养板中培养。待第二天细胞增至80%左右,将质粒转染至两株细胞中。24小时后荧光显微镜判断转染效率。转染24小时后,细胞1：100倍数稀释传代到96孔板中,一天后换成600μg/ml(MKN45)和400μg/ml (AGS) G418进行筛选,每2-3天换培液与G418。3周后,挑取单克隆生长细胞株,继续筛选1周,改维持浓度,持续压力筛选。荧光显微镜判断筛选效果。为了进一步验证RegⅠαRNAi稳定转染的建立,应用RT-PCR和Western blot测定转染后细胞Reglα基因及其蛋白的表达水平。RT-PCR结果显示：与空载体组相比,转染RegⅠα小RNA干扰质粒后,MKN45和AGS细胞的ReglαmRNA明显被抑制；Western blot结果显示：MKN45, AGS细胞的RegⅠα蛋白表达水平分别降低,是空载体组的(44±4)%和(25±4)%。为了观察ReglαRNAi对胃癌细胞生长周期的影响,我们应用了MTT法连续观察4天,结果发现：RegⅠα小RNA干扰后MKN45与AGS细胞增殖均受到抑制,细胞从第二天开始生长变慢,形态多数呈杆状或梭形,部分呈三角形或不规则形,细胞空泡现象较空载体组常见,说明Reglα小RNA干扰可以抑制细胞生长。我们进一步用Annexin V-FITC/PI双标记法流式细胞仪分析RegⅠαRNAi对胃癌细胞的凋亡作用,结果显示：RegⅠαRNAi稳定转染MKN45和AGS细胞后,凋亡率分别为(12.96±0.5)%和(11.59±1.1)%,较空载体组凋亡率(3.99±0.3)%和(4.22±0.4)%明显增高(P<0.05),说明RegⅠα小RNA干扰可以诱导细胞凋亡。结论：(1)MKN45和AGS胃癌细胞株高表达RegⅠαmRNA.(2)MKN45和AGS转染RegⅠαRNAi后,RegⅠαmRNA表达水平明显被抑制；RegⅠα蛋白表达水平下降。(3) RegⅠa小RNA干扰可以抑制MKN45和AGS生长,诱导凋亡。