前言:　　 支气管哮喘(bronchialasthma)是由多种细胞、炎症介质及细胞因子共同参与的,以气道炎症和气道高反应性为特征的疾病。Th1/Th2失衡是其主要的免疫学改变,也是气道炎症和气道高反应性发生发展的关键。病毒感染因影响Th1/Th2平衡而成为哮喘形成和发作的重要诱因。引起婴幼儿毛细支气管炎和肺炎的主要病原体是呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV),其与哮喘的相关性研究受到高度重视。研究提示RSV感染不仅是哮喘发生发展的重要影响因素,而且RSV感染时机影响机体Th1/Th2平衡及气道变态炎症反应结果,但在此过程中有哪些因素参与其中并发挥相应的生物学作用尚不清楚。　　 广泛分布于皮肤粘膜系统的γδT细胞作为具有免疫学效应和调节功能的T细胞亚群,影响呼吸道粘膜局部病原体感染模式和过敏性炎症反应过程。γδT细胞在RSV感染对气道变态炎症反应的影响过程中具有怎样的生物学作用,目前尚不清楚。为此,本研究利用OVA诱发的哮喘模型鼠,采用致敏前、后RSV感染模式,深入探讨在RSV感染对气道变态炎症发生发展影响过程中,γδT细胞的作用以及免疫应答调控机制。将RSV感染、γδT细胞、过敏性哮喘三者联系起来,从新的视角阐明病毒感染影响哮喘形成和发作的机理,为临床评价呼吸道病毒感染预后及防治支气管哮喘提供理论和实验依据。　　 实验材料和方法:　　 1、实验用试剂　　 试剂:卵清蛋白(OVA)、HE染液、瑞氏染液、胶原酶Ⅰ、DnaseⅠ、淋巴细胞分离液、水合氯醛、RPMI-1640培养液、标准胎牛血清、0.01MPBS缓冲液、红细胞裂解液、胰酶、荧光标记单克隆抗体(PE-anti-TCRδmAb;FITC-anti-CD40LmAb;FITC-anti-CD69mAb)等。　　 试剂盒:ELISA检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、Real-timeRT-PCR试剂盒。　　 2、病毒的繁殖与滴定　　 用Hep-2细胞繁殖人类呼吸道合胞病毒A2型(RSVA2),30%蔗糖超速离心法分离病毒,-80℃冰箱保存。病毒滴度用组织细胞半数感染量(TCID50)表示。　　 3、实验性哮喘动物模型　　 动物:将购于中国科学院上海实验动物中心的SPF级6～8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组8只,分别是实验组,包括致敏前RSV感染组(RSV/OVA)和致敏后RSV感染组(OVA/RSV)以及对照哮喘组(OVA)。　　 哮喘模型:小鼠二次腹腔注射0.1ml含20pgOVA和2.25mg氢氧化铝的乳化液致敏,二次注射间隔为2周。末次致敏后第14天,小鼠吸入超声雾化的1%OVA生理盐水20分钟,每天1次,持续3天。末次雾化吸入后第2天收集标本。　　 RSV感染模式:病毒感染时间选择在初次致敏前第7天(致敏前RSV感染)和末次致敏后第7天(致敏后RSV感染)。经鼻粘膜感染20μl含2×106TCID50RSV的病毒悬液。　　 4、标本采集与检测方法　　 (1)肺组织病理标本制作及染色:取模型鼠左肺下叶,制备石蜡切片,常规HE染色,光学显微镜观察肺组织形态结构及炎症反应情况。　　 (2)肺组织淋巴细胞的提取:水合氯醛深度麻醉小鼠,经心脏灌流去除血管内血细胞后取肺组织。用含有200μg/ml胶原酶Ⅰ和30μg/mlDnaseⅠ的培养液消化处理肺组织,淋巴细胞分离液分离肺淋巴细胞。　　 (3)肺泡灌洗液(BALF)的收集及炎性细胞的分类与计数:用1mlPBS经支气管冲洗肺组织,收集肺泡灌沈液。离心后取细胞悬液作涂片,瑞氏染色后显微镜下随机选择视野,计数200个细胞,分别计数中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞数量。　　 (4)ELISA法检测血清中过敏原特异性抗体含量:10μg/mlOVA包被96孔板,4℃过夜后1%BSA封闭30分钟,加稀释的血清样本培养1小时后,分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgE、IgG1、IgG2a抗体,邻苯二胺显色,490nm波长读取OD值从标准曲线获取血清抗体含量。　　 (5)实时荧光定量(Real-time)RT-PCR技术检测细胞因子mRNA水平:用RNA提取试剂盒提取肺组织总RNA,采用Real-timeRT-PCR技术检测Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的mRNA表达水平。　　 (6)脾细胞分离及其悬液制备:颈椎脱位处死小鼠,常规无菌制备脾细胞悬液,调整细胞浓度至1×106/ml。　　 (7)流式细胞仪检测脾和肺组织中活化的γδT细胞数量:调整小鼠淋巴细胞浓度至1×106/ml。加入PE标记的anti-TCRδmAb以及FITC标记的anti-CD40LmAb或anti-CD69mAb,避光冰浴30分钟,冷的PBS洗涤两次,震荡混匀细胞后上机检测。　　 (8)γδT细胞回输实验:末次雾化吸入后第2天无菌分离OVA组小鼠脾淋巴细胞,流式细胞分选仪分选PE-anti-TCRδmAb标记的γδT细胞,用RPMI-1640调整细胞浓度为1×106/ml,从小鼠尾静脉回输分选的γδT细胞,2×104/鼠,细胞回输时间为初次雾化吸入前1小时。　　 (9)统计学分析:采用SPSS16.0软件进行统计学分析,实验结果以-X±S表示,组间比较采用t检验分析。P＜0.05判定为有统计学意义。　　 实验结果:　　 1、致敏前感染RSV减轻哮喘鼠肺炎症反应　　 经OVA致敏和激发的BALB/c鼠气道上皮增厚、管腔狭窄、肺组织内炎性细胞总数和嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞数量明显增加。致敏前感染RSV显著抑制OVA诱导的肺炎症反应,减轻模型鼠肺组织内炎性细胞浸润。但致敏后RSV感染却对OVA诱发的气道炎症无明显影响。　　 2、致敏前RSV感染降低哮喘鼠肺组织内炎症细胞数量　　 OVA哮喘鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数和嗜酸性粒细胞、巨噬细胞数量明显增加。致敏前RSV感染降低哮喘鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞和巨噬细胞数量,但致敏后RSV感染对小鼠肺炎症细胞浸润无明显影响。　　 3、致敏前RSV感染降低哮喘鼠血清总IgE和过敏原特异性IgE、IgG1抗体水平　　 二次腹腔注射和三次雾化吸入明显升高BALB/c鼠血清总IgE和OVA特异性IgE、IgG1水平。而致敏前RSV感染降低哮喘模型鼠血清总IgE、OVrA特异性IgE和IgG1含量。但致敏后RSV感染对OVA特异性血清抗体的产生无明显影响。　　 4、致敏前感染RSV影响哮喘鼠肺细胞Th1/Th2型细胞因子mRNA表达　　 致敏前RSV感染明显抑制哮喘鼠肺组织细胞IL-4mRNA的表达,但增强肺局部IFN-γmRNA表达水平。与OVA组相比,RSWOVA组小鼠肺组织IL-4mRNA由0.39±0.08降低至0.28±0.07,而IFN-γmRNA水平由0.11±0.05升高至0.23±0.12。与此相反,致敏后感染RSV对OVA诱导的Th1/Th2型细胞因子mRNA表达水平无明显影响。　　 5、致敏前感染RSV降低哮喘鼠脾及肺组织内γδT细胞总数及其活化细胞数量　　 致敏前感染RSV显著降低哮喘鼠脾和肺组织内γδT细胞总数,表达CD40L和CD69的活化γδT细胞数亦因RSV感染而明显下降。与此相反,致敏后感染RSV则对哮喘鼠脾和肺组织中γδT细胞数量无明显影响。　　 6、γδT细胞参与RSV感染对哮喘鼠气道变态炎症的影响作用　　 正常小鼠回输了来自OVA哮喘鼠的γδT细胞后,肺炎性细胞数量明显上升,其中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞百分比增加明显,而巨噬细胞百分比显著下降。回输了Y6T细胞的RSV/OVA组鼠肺炎性细胞数与未回输组相比也明显增多,嗜酸性粒细胞百分比显著升高。　　 结论:　　 1、RSV感染模式影响过敏原诱发的气道炎症反应。　　 2、致敏前RSV感染通过改变γδT细胞数量及其细胞因子分泌活性.左右气道变态炎症反应过程。　　 3、在本实验体系中γδT细胞发挥促炎作用。