论文部分内容阅读
卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,其总体5年死亡率跃居首位,给全球公共卫生带来了巨大的压力。尽管目前外科手术治疗联合传统的化疗在卵巢癌的治疗上取得了很大的进展。然而,由于卵巢癌细胞的转移,绝大部分晚期患者在5年内复发。因此,确定新的分子靶向诊断和治疗对于卵巢癌患者来说是非常紧迫的。长链非编码核糖核酸（long non-coding ribonucleic acid,lncRNA）SOX2重叠转录（SRY-box 2 overlapping transcript,SOX2OT）是维护自我更新、未分化干细胞多潜能性和肿瘤发生的必需转录因子,影响着机体的生理病理过程,目前成为肿瘤研究的焦点之一。目前研究表明,很多异常表达的lncRNA SOX2OT通过表观遗传学水平、转录水平、转录后水平进行基因表达调控,通过产生一个繁杂且重要的基因调控网络,发挥其重要的效力及功能,参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。然而,lncRNA SOX2OT在卵巢癌增殖、迁移及侵袭中的具体机制至今仍未阐明。近年来,国内外有少量文献报道lncRNA SOX2OT与其它肿瘤的关系,但尚缺乏关于lncRNA SOX2OT与卵巢癌之间关系的研究。因此,研究lncRNA SOX2OT在卵巢癌中的表达情况,以及对卵巢癌增殖、迁移及侵袭作用的影响,对于卵巢癌的诊断、预后和治疗具有较高临床价值。本课题从以下三部分进行了研究:①本研究采用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测105例卵巢癌、癌旁组织以及卵巢癌细胞系中lncRNA SOX2OT的表达情况,分析lncRNA SOX2OT表达水平与卵巢癌各临床病理特征之间的关联,同时评估lncRNA SOX2OT是否对卵巢癌患者的预后有重要指导意义。②采用小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）转染卵巢癌细胞,构建lncRNASOX2OT低表达的卵巢癌细胞株,通过克隆形成实验、细胞周期检测、细胞迁移和侵袭实验观察卵巢癌细胞增殖、周期、迁移和侵袭等生物学过程是否受到lncRNA SOX2OT的影响。③采用蛋白免疫印记法（Western Blot,WB）检测转染前后人卵巢癌细胞株H0-891OPM中关键的细胞调控蛋白（Cyclin B1、Cdc25C）以及上皮细胞-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transitions,EMT）的标志物（E-cadherin,N-cadherin）的表达情况,进一步明确lncRNA SOX2OT影响卵巢癌增殖和侵袭作用的具体分子机制。第一部分lncRNA SOX2OT在卵巢癌中的表达检测及临床意义目的:通过检测卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中lncRNA SOX2OT的表达水平,探讨lncRNA SOX2OT与卵巢癌患者各临床病理特征的关联性及其预后意义。方法:通过q RT-PCR方法研究lncRNA SOX2OT在105例卵巢癌、癌旁组织以及卵巢癌细胞系HO-8910和HO-8910JPM中的表达情况,分析其表达和卵巢癌各个临床病理特征之间的关联性,同时评价lncRNA SOX2OT是否对卵巢癌患者的预后有重要指导意义。结果:①lncRNA SOX2OT mRNA在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.05）,HO-8910PM细胞株中lncRNASOX2OT mRNA的表达水平明显高于HO-8910细胞株（P<0.05）。②lncRNA SOX2OT较高表达与发病年龄、肿瘤大小、肿瘤TNM分期以及淋巴结转移显著相关（P<0.05）,与家族情况无明显相关性（P>0.05）。结论:lncRNASOX2OT在卵巢癌中高表达,且lncRNASOX2OT与患者发病年龄、肿瘤大小、肿瘤TNM分期以及淋巴结转移显著相关,与家族情况无明显相关性。提示lncRNA SOX2OT在卵巢癌发生发展中发挥重要作用。第二部分lncRNA SOX2O影响卵巢癌细胞侵袭转移的分子机制研究目的:研究lncRNA SOX2OT影响卵巢癌细胞增殖、周期、迁移和侵袭等生物学行为的分子机制。方法:采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术作为主要的研究工具,用siRNA转染卵巢癌细胞,构建lncRNASOX2OT低表达的卵巢癌细胞株,并通过克隆形成实验、细胞周期检测、细胞迁移和侵袭实验观察lncRNA SOX2OT对卵巢癌细胞增殖周期、迁移和侵袭等生物学行为的影响。结果:①当H0-8910PM细胞用siRNA转染后,SOX2OT的表达显著减少。②两种siRNA转染后的H0-8910PM细胞的克隆形成能力显著性降低50%。③细胞周期分析显示:用两种siRNA敲除H0-8910PM细胞中SOX2OT的表达后,G0/G1期的细胞数增加15%,并且S期和G2/M期的细胞减少。④Transwell小室迁移实验和细胞侵袭实验结果显示,转染了 siR-SOX2OT-1的H0-8910PM细胞迁移至小室和粘附于膜底层的数量明显减少,转染了 siR-SOX2OT-2的H0-8910PM细胞个数下降得更低。结论:lncRNA SOX2OT可能促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭,并且和卵巢癌患者的预后密切相关,这表明SOX2OT可能作为卵巢癌治疗中的一个潜在的靶点。第三部分IncRNA SOX2OT通过细胞周期调控和EMT现象影响卵巢癌细胞侵袭及转移的机制研究目的:探讨IncRNA SOX2OT通过细胞周期调控及EMT现象影响卵巢癌细胞侵袭及转移的机制方法:采用蛋白免疫印记法检测转染前后人卵巢癌细胞株H0-8910PM中关键的细胞调控蛋白:细胞周期蛋白Bl（CyclinBl,Cyc-Bl）、细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cyclin 25 homolog C,Cdc25C）、EMT标志物:E-轉辭附蛋白（E-cadherin,E-cad）、N-钙黏附蛋白（N-cadherin,N-cad）的表达情况,从而明确lncRNA SOX2OT促进卵巢癌增殖和侵袭的具体分子机制。结果:在敲除SOX2OT的H0-8910PM细胞中可以检测到关键的细胞周期调节因子Cyclin B1,Cdc25C,N-cadherin均下降,而E-cadherin升高。结论:①SOX2OT促进卵巢肿瘤的生长②敲除SOX20T的卵巢癌细胞抑制细胞增殖和迁移,这可能是通过细胞周期阻滞和促进EMT进程而实现的。③EMT过程启动与卵巢癌化疗耐药性有关,因而EMT可能作为卵巢癌诊断和治疗的潜在靶点。