研究背景:基于组织工程技术的角质形成细胞膜片移植为修复创面提供了新的方法。常规的自体角质形成细胞膜片移植存在制备成本高、制备周期相对较长（3～4周）、移植存活率不稳定以及病毒传播风险等。本研究基于传统角质形成细胞膜片体外构建理论,尝试以低温氧气等离子体改性聚氨酯膜为载体,以未经生长停滞处理、来源于幼儿包皮组织的异体成纤维细胞为滋养层,在不含胎牛血清的培养体系中高效扩增人源异体角质形成细胞,从而快速构建含有异体角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片,并进一步通过单中心、前瞻性随机对照试验观察其在II度烧伤创面的治疗效果。第一部分:基于低温氧气等离子体改性聚氨酯膜构建含人源角质形成细胞及成纤维细胞膜片研究目的:以经低温氧气等离子体改性处理的聚氨酯膜为载体,构建含有人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片。研究方法:为实现具有较高生物学活性、含有人源角质形成细胞及成纤维细胞膜片的体外构建,本课题组从新生儿到7岁儿童包皮术后获取的包皮组织中分离原代角质形成细胞及成纤维细胞,并进一步传代扩增,建立人源角质形成细胞及成纤维细胞库。为保证组织来源的安全性,须在包皮环切术前,对捐赠者本人进行内科体检、外科体检、包皮真菌涂片学检查、血尿常规、肝肾功能及HIV1/HIV2、乙肝两对半、HCV、巨细胞病毒、EB病毒、梅毒、单纯疱疹病毒（HSV）等病原学检查。随后以聚氨酯膜为细胞培养、移植载体,对聚氨酯膜行激光打孔及低温氧气等离子体表面改性处理,以进一步增强膜片的引流性、生物相容性。将体外培养扩增的人源成纤维细胞以2×10⁵/cm²接种于经上述处理的聚氨酯膜表面,待细胞贴壁后以成纤维细胞与角质形成细胞数量比为1:8～1:10的比例继续种植角质形成细胞,观察细胞生长粘附情况。待细胞完全融合后即完成细胞膜片的制备,并对细胞膜片进行组织学切片、HE染色等检查。研究结果:经低温氧气等离子体表面改性后,聚氨酯膜的生物相容性良好,当人源成纤维细胞以2×10⁵/cm²的密度接种且两种细胞接种比例为1:8和1:10时,细胞完全融合后角质形成细胞集落形成面积可达80%以上,体外培养扩增周期约2～3天。纵切面组织学检查该细胞膜片具有1～3层细胞,角质形成细胞与成纤维细胞界限清晰,成纤维细胞分泌大量细胞外基质包裹角质形成细胞集落。从而快速构建含有人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片。研究结论:成功构建了以低温氧气等离子体表面改性聚氨酯膜为载体,同时含有人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片。该膜片在制备过程中在特定接种密度比例的条件下未发现成纤维细胞过度生长现象,且在适当提高细胞接种密度时可实现细胞膜片的快速制备。第二部分:含人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片安全性、传染病风险检测及临床试验伦理审查。研究目的:检测含人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片的生物安全性以及传染病传播风险,并提交相关材料至本单位伦理审查部门进行临床试验伦理审查。依据中华人民共和国医疗器械生物学评价国家标准（GB/T16886.5、GB/T16886.10）,选取构建的含人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片为试验对象,对其进行迟发性超敏反应试验、皮肤刺激试验、细胞毒性试验。每位皮肤捐赠者的原代角质形成细胞及成纤维细胞成功培养后,取第0代细胞培养液送医院检验科进行传染病风险检查（乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病病毒、梅毒）。随后递交临床研究方案以及安全性评价材料至本单位伦理委员会审批。研究结果:生物安全性检测以及传染病风险检测结果表明,细胞膜片无细胞毒性,且对试验动物无皮肤刺激性,无迟发性超敏反应发生。经海军军医大学第一附属医院伦理委员会审查细胞膜片临床试验方案以及相关安全性检测资料后,同意通过含人源角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片的临床试验方案。第三部分:含异体角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片治疗II度烧伤创面的临床研究研究目的:临床评价含异体角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片治疗Ⅱ度烧伤创面的效果与安全性。研究方法:以低温氧气等离子体表面改性聚氨酯膜为载体构建含人异体角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片,于2016年4月～2017年12月,海军军医大学第一附属医院烧伤外科对具有符合入选标准的急性Ⅱ度烧伤创面的患者进行前瞻性、阳性自身对照的临床试验研究。拟入组40个Ⅱ度烧伤早期创面,选择的单个创面≥10cm×10cm,≤5%体表总面积（TBSA）,将创面均分为2个区,采用用计算机随机数法分别纳入细胞膜片组和常规治疗组创面。细胞膜片组创面内层覆盖细胞膜片、外覆无菌纱布,视创面愈合及渗出情况于治疗开始后每1～3天更换外层纱布,每7天更换1次细胞膜片。常规治疗组创面内层覆盖涂抹磺胺嘧啶银霜的纱布,外敷无菌纱布,视创面渗出情况每1～3天更换内外层纱布。分别于治疗5、7、10、14天,计算2组创面愈合率;记录创面完全愈合时间、换药总次数、治疗期间创面感染情况;首次换药时行视觉模拟疼痛评分;伤后6～12个月,随访创面瘢痕形成情况。观察安全性指标包括生命体征和实验室检查指标及不良反应。计量资料以中位数、四分位距(M(P₂₅,P₇₅))表示,对数据进行Wilcoxon秩和检验及Bonferroni校正。研究结果:（1）共入选43例患者,其中3例脱落。完成治疗的患者中,男22例、女18例,1～57岁,烧伤总面积为2%～26%TBSA。（2）治疗5、7、10、14天,细胞膜片组创面愈合率均明显高于常规治疗组（P<0.05）。细胞膜片组创面完全愈合时间为7（5.75,8.5）天,明显短于常规治疗组的11（7,14）天（Z=4.219,P<0.05）。细胞膜片组创面换药总次数为1（1,2）次,明显少于常规治疗组的6（4,7）次（Z=5.464,P<0.05）。（3）31例患者细胞膜片组创面在首次更换细胞膜片前创面即已愈合,9例患者细胞膜片治疗组创面首次换药疼痛评分为1（0,1）分,40例患者常规治疗组创面首次换药疼痛评分为2（1,3）分。40例患者2组创面完全愈合前均未见有明显感染发生。试验结束后,9例患者随访显示,6例患者细胞膜片组创面与常规治疗组创面均未见瘢痕形成,细胞膜片组创面与正常肤色基本接近,仅见常规治疗组创面少量色素沉积;另3例患者细胞膜片组创面仅有色素沉积,而常规治疗组创面瘢痕形成明显。（4）所有患者治疗期间体温、血压、心率、呼吸频率等各项生命体征指标及实验室检查指标异常波动主要随烧伤病程演进及创面愈合自行缓解,未见明显与治疗相关的不良反应与异常表现。研究结论:含人异体角质形成细胞及成纤维细胞的细胞膜片可减少Ⅱ度烧伤创面换药次数、加速创面上皮化、缩短愈合时间、减轻换药疼痛,且因细胞膜片组创面愈合更快,可能有利于减轻后期瘢痕形成。其临床应用简便、安全、有效。