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背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery heart disease,CHD)作为临床常见的心血管疾病,已成为威胁人类生命和健康的“第一杀手”,其在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)疾病中占很大比例,发病率逐年攀升。目前已证实CHD是一种冠状动脉全身免疫性及慢性炎症疾病,多种免疫细胞参与AS从稳定到易损的全过程。新近的研究认为树突状细胞(dendritic cells,DCs)是参与AS免疫反应的主要免疫细胞之一,它对AS起着激活T细胞、呈递脂质抗原的重要作用,DCs的聚集与增加可促进斑块的进展与不稳定性。在这种背景下,从免疫学角度探索中医药防治CHD具有重大意义。按照病因、病位、病机分类,CHD属于中医胸痹心痛范畴,临床表现为起病急骤、病情变化多端,类似中医风证,导师王显教授根据多年临床经验,提出动脉粥样硬化“络风内动”学说,创制了具有祛风活血通络作用的络衡方,已获得较好的临床疗效。前期研究中已证实络衡方有一定的抗炎作用及药效学基础。目的在络衡方大、中、小浓度含药血清的作用下,观察络衡方干预前后DCs免疫成熟过程中特征性分子标志物的变化及组间差异,为祛风活血通络法治疗CHD提供一定的科学依据,进一步佐证“络风内动”病机学说。方法①络衡方含药血清的制备:30只实验大鼠随机分组,按照人与动物千克体重换算给药剂量,经大、中、小浓度的络衡方颗粒剂溶液对大鼠灌胃7天后,经腹主动脉采血制备含药血清,用于细胞实验;②人DCs的分选及培养:选择经冠状动脉造影(coronary angiogram,CAG)证实的CHD患者8例,健康志愿者2例,通过外周血分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),利用免疫磁珠法,从人PBMC中分选纯化后的CD14+单核细胞接种于培养瓶中,隔日半量用100ng/mlrhGM-CSF,50ng/mlhIL-4的含10%胎牛血清1640换液,换液前后及时观察DCs细胞生长情况;③将实验分为对照组(DC+PBS组)、DC+ox-LDL组、DC+ox-LDL+正常组血清、DC+ox-LDL+络衡方大浓度组血清、DC+ox-LDL+络衡方中浓度组血清、DC+ox-LDL+络衡方小浓度组血清,用ox-LDL作为抗原诱导DCs,培养24h后,通过倒置显微镜观察各组DCs形态的变化,扫描电镜观察DCs超微结构的变化,台盼蓝染色检测细胞活性,MTT法观察不同浓度的络衡方的干预对DCs增殖能力的影响,用流式细胞仪检测络衡方干预后的DCs表面CD1a、CD80、CD83、CD86的表达情况;结果①络衡方含药血清制备过程中,无大鼠死亡,均完成含药血清的采集;②通过免疫磁珠法分离纯度较高,各组均在90%以上。镜下可见,刚分离纯化的CD14+单核细胞大部分处于贴壁状态,体积较小,纯度较高,细胞核为圆形或椭圆形,培养24小时可见细胞散在、均匀分布,逐渐脱壁悬浮,培养到第3天,可见细胞呈半贴壁半悬浮状态,细胞体积逐渐变大,数量变多,培养至第6天,绝大多数细胞悬浮,少数细胞贴壁,部分细胞周围有隐约可见的毛刺装突起,分布不均匀,细胞核偏位,DCs已初步形成。③分组后倒置显微镜下可见未加入络衡方的DCs数量明显增多,细胞膜周围生长大量簇状毛刺,络衡方组细胞数量减少,分化成熟度较单纯ox-LDL组低。扫描电镜观察DCs的超微结构可见1000×电镜下细胞悬浮生长,结构完整,细胞核偏移,除外PBS组,余五组可见细胞表面粗糙,凹凸不平,细胞膜上树突状结构明显,络衡方干预组和模型组及正常血清组相比,树突状结构减少,以小浓度组最为显著。3000X电镜下可见模型组和正常血清组相似度较大,胞质较长,多有凹陷,细胞表面分布大量毛刺状突起,细长而密。络衡方大浓度组细胞表面粗糙,有大量层叠状皱褶,细胞膜表面毛刺较短、稍钝,呈周围性分布,中、小浓度组细胞表面皱褶减少,树突状结构较少;台盼蓝染色结果显示:8例冠心病患者外周血提取的DCs经ox-LDL介导后分化良好,存活率大于85%;MTT法示细胞活力未有明显差异,具备继续分组实验条件。随着血清药物浓度的继续加大,OD值出现缓慢下滑,不排除存在潜在的细胞毒性。④通过ox-LDL诱导培养后DCs表面CD1a、CD80、CD83、CD86与空白组相比,表达量均明显增加,差异有统计学意义(P均<0.01);对照血清组与模型组相比特异性分子标志物(CD1a、CD80、CD83、CD86)表达量无明显变化,差异无统计学意义(P均>0.05),符合用络衡方继续分组干预的条件。络衡方大、中、小浓度组血清干预后,DCs表型分子CD1a、CD80、CD83、CD86的表达均下调,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中以小浓度组血清下调作用最明显,中浓度组血清次之,大浓度组血清再次之,组间比较,差异有统计学意义(P均<0.01)。结论络衡方能够抑制DCs活化成熟与特征性分子标志物(CD1a、CD80、CD83、CD86)的表达,为“络风内动”病机的临床应用提供了科学依据。