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庆大霉素及其生物合成中间体大部分具有重要的临床应用价值。庆大霉素生物合成过程经过一系列基团的修饰,如:甲基化、氨基化和氨甲基化等,但参与修饰基团的基因多数未被阐明。本研究在分子水平上探索修饰庆大霉素关键基团的基因,借助分子遗传学技术,对genT、genN、genY、genB1和genM1进行敲除研究,分析基因缺失突变对庆大霉素生物合成代谢的影响,揭示基因在修饰庆大霉素关键基团中的作用。第一,genT基因功能的研究。以pJTU412为载体,构建用于genT基因敲除的同源重组质粒pFT104,通过接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,获得单交换菌株GDT105,经松弛培养后,筛选获得genT基因缺失突变菌GT106。突变菌经摇瓶发酵,提取代谢产物经MS分析,结果显示,与出发菌G1008相比,GT106仍合成庆大霉素C1、C2、C2a、C2b和C1a。表明genT未影响修饰绛红糖胺C-6’位的氨甲基化。第二,genN基因功能的研究。以pKC1139为基本载体,构建用于genN基因缺失的同源重组质粒pFTN203,在GT106上敲除genN基因得到突变菌GTN205。在GTN205基础上,进一步敲除genK基因(C-6’位甲基化酶基因),得到突变菌GTNK308。突变菌代谢产物经MS分析,结果显示,GTN205不再合成庆大霉素C1和C2b,而主要积累庆大霉素C2和C1a;GTNK308不再合成庆大霉素C2b,主要积累庆大霉素C1a、A2和A。证明genN基因失活阻断了庆大霉素C1与C2b的合成,genN基因在修饰庆大霉素绛红糖胺C-6’位氨甲基化中起关键作用,可能是编码N-甲基转移酶的基因。第三,genY基因功能的研究。采用与研究genN相似的方法,构建同源重组质粒pFY303,在G1008和GK1101上分别敲除genY基因获得突变菌GY305和GKY307。突变菌代谢产物经MS分析,结果显示,GY305和GKY307的代谢产物均积累西索米星、庆大霉素C1a和C2b,而不再合成C1和C2。暗示了gen 基因可能参与修饰庆大霉素绛红糖胺C-6’位甲基化。第四,genB1基因功能的研究。采用与研究genY相似的方法和出发菌株,构建同源重组质粒pFB1403,在G1008和GK1101上分别敲除genB1基因获得突变菌GB1405和GKB1407。突变菌代谢产物经MS分析,与G1008和GK1101相比,GB1405和GKB1407代谢产物组分并未发生明显变化。结合体外表达发现,GenB1、GenB2、GenB3和GenB4各自具有催化C-6’位氨基化的活性。本章通过genB1的失活并未阻断庆大霉素C族的合成,推测突变菌中的其他氨基转移酶基因genB2、genB3和genB4编码的氨基转移酶可以催化C-6’位的氨基化,使突变菌中庆大霉素C族合成代谢流不被阻断。第五,genM1基因功能的研究。采用相似的研究方法,构建同源重组质粒pFM1503。在G1008上敲除genM1基因获得突变菌GM1505。其代谢产物经MS分析,主要积累2-DOS,证明genM1为编码D-葡萄糖转移酶的基因,参与第一步糖基化作用。