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许多研究结果表明碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）直接与成骨细胞联合植入体内能明显促进骨形成过程，这对临床治疗骨折、骨缺损、骨坏死等骨科疾病有一定的效果。但是bFGF在体内易降解，因此bFGF和成骨细胞联合植入时直接外源给予bFGF需反复多次注射，造成使用不方便、易感染，而且bFGF浓度不易控制，影响疗效。因此本课题设计基因治疗与骨组织工程学相结合的方法以改变外源性加入bFGF蛋白的不足之处，即将成骨细胞经bFGF基因转染后进行体外扩增，并进一步研究其体内外成骨能力，得出如下结果： 应用PCR技术从克隆载体PBR322-bFGF载体上扩增获得bFGF cDNA基因，采用基因重组技术将bFGF cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-C3上。重组质粒分别经双酶切、PCR分析及序列测定验证了插入片段的正确性后，用脂质体介导重组质粒pcDNA3.1-bFGF和pEGFP-C3-bFGF转染3T3细胞。荧光显微镜观察转染细胞的荧光表达情况，细胞爬片免疫组化以及细胞培养上清的ELISA检测bFGF表达情况。结果表明pcDNA3.1-bFGF和pEGFP-C3-bFGF可表达bFGF蛋白，而且pcDNA3.1-bFGF能够分泌表达bFGF蛋白。 研究中通过比较分批消化收集法和植块培养法分离培养成骨细胞的效果，确定采用这两种方法相结合即植块消化培养法分离成骨细胞，而后对所分离的细胞进行了鉴定并研究了其生长曲线，结果发现细胞前二天处于适应期，从第三天开始进入对数生长期，当培养至第8天进入稳定期。取对数生长期细胞进行bFGF重组质粒转染。 以pEGFP-C3-bFGF重组质粒转染成骨细胞，比较脂质体(LipofectamineTM2000)和聚乙烯亚胺(jetPEITM)转染成骨细胞的情况，结果发现虽然脂质体的转染效率要高于聚乙烯亚胺，但其对细胞的毒性也大于聚乙烯亚胺，因此确定采用聚乙烯亚胺介导bFGF基因转染成骨细胞。通过荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况确定重组质粒在成骨细胞内代谢时间大约为14天，G418粗筛阳性克隆的浓度为600ug／ml。 将pcDNA3.1-bFGF重组质粒转染成骨细胞，进行bFGF基因在成骨细胞中表达情况和bFGF基因转染对成骨细胞生物学性质的影响研究。RT-PCR、细胞免疫组化、Western Blot、ELISA及MTT细胞增殖实验等分析结果表明：pcDNA3.1-bFGF成功转染成骨细胞并分泌表达bFGF蛋白；所表达的bFGF具有促进3T3细胞增殖的生物学活性。通过比较pcDNA3.1-bFGF转染前后成骨细胞生长曲线以及碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白分泌情况，显示转染成骨细胞的适应期延长至3—4天，