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禽腺病毒（Fowl adenovirus,FAdV）属于腺病毒科、腺病毒属的DNA病毒,根据共同群抗原,Ⅰ亚群禽腺病毒目前可分为5个种（A-E）,12个血清型（血清型1-7、8a、8b、9-11）。禽腺病毒4型（FAdV-4）引起的疫病俗称“安卡拉”病,引起严重的心包积液综合征,呈现世界性分布。自2015年7月以来,在中国的河南、河北、辽宁、吉林、黑龙江、新疆、安徽、山东、江西、湖北、江苏等省鸡场爆发流行,给养禽业造成巨大的经济损失。市场上许多禽弱毒活疫苗均已被证实存在禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）和禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）等外源病毒的污染,巴基斯坦也曾报道禽腺病毒的大规模传播可能因为疫苗中潜在的病毒污染造成;2016年,我国通过使用PCR方法在新城疫弱毒活疫苗中分离鉴定到禽腺病毒4型。随着分子生物学技术的快速发展,病毒检测的方法也在不断的更新。疫苗中的外源病毒污染通常是低剂量的,这对检测疫苗中是否存在禽腺病毒Ⅰ群的污染提出了更高的要求。为此,本研究建立了禽腺病毒的PCR结合核酸斑点杂交、TaqMan探针荧光定量PCR和微滴式数字PCR等检测方法,为感染禽腺病毒的鸡群提供快速的检测技术手段,同时有助于疫苗动保企业能够快速准确的检测禽弱毒活疫苗中禽腺病毒的污染,对促进养禽业健康发展具有重要意义。首先,对禽腺病毒4型疫苗污染毒株FAdV-N22株进行鸡胚扩增并测定其鸡胚半数感染量(EID50),根据GenBank上已发表禽腺病毒的hexon基因序列,使用Lasergene7.0软件分析该序列并编辑选中保守的区域,用Primer 5.0软件编辑设计合成了2对引物,其中包括Dot-F1/Dot-R1扩增引物制备标记探针、Hexon-F2/Hexon-R2引物和TaqMan探针。通过聚合酶链式反应（PCR）使用Dot引物扩增DNA片段,将此PCR回收产物用Digoxigenin标记后作为探针建立斑点杂交方法,利用引物Hexon-F2/R2和TaqMan探针建立了荧光定量PCR和微滴式数字PCR的方法。对建立的三种方法进行反应时间、退火温度等条件的优化,先后进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,PCR结合核酸斑点杂交的方法可以检出质粒标准品的最低浓度为1,000 copies/μL,TaqMan荧光定量PCR的方法可以检出质粒标准品的最低浓度为100 copies/μL,而微滴式数字PCR可以检出质粒标准品的最低浓度为10 copies/μL。同时在本研究中,我们通过人工模拟禽弱毒活疫苗中禽腺病毒污染,普通PCR仅能检测疫苗中100 EID50/1,000羽份禽腺病毒的污染,PCR结合斑点杂交方法可以检测到疫苗中5 EID50/1,000羽份的污染,TaqMan荧光定量的方法可以检出疫苗中1 EID50/1,000羽份的污染,而微滴式数字PCR可以检测疫苗中最低0.1EID50/1,000羽份污染。综上所述,本研究建立的三种禽腺病毒的分子检测方法都能快速有效的检测弱毒疫苗中低剂量的禽腺病毒的污染,微滴式数字PCR对弱毒疫苗中低剂量污染的检测更加敏感。其中,TaqMan荧光定量PCR和微滴式数字PCR可以有效的对禽腺病毒进行定量检测,同时为临床提供了微滴式数字PCR这种新的定量检测方法,可以更加准确的监测病毒载量的变化,进一步揭示弱毒疫苗低剂量污染与禽腺病毒病的发生与病毒大规模爆发流行的内在联系。