矽肺病(Silicosis)是在生产过程中长期吸入含较高浓度游离二氧化硅(SiO2)粉尘所导致的以肺部组织弥漫性纤维化为主的全身性疾病,在煤碳、冶金、铁道及建材等工业行业中发病率较高,是我国最严重的职业病之一。大量研究表明矽肺纤维化的重要病理特征为成纤维细胞过度增殖,成纤维细胞向肌成纤维细胞分化以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积。矽肺的发病机制尚未完全阐明,目前无特效治疗方法,因此探明矽肺的发病机制,对于研究有效的矽肺预防、诊断和治疗方法十分重要。近年来有研究表明,细胞自噬与microRNA (miRNA)在肺纤维化发生过程中均发挥重要的作用。自噬作为细胞经典的能量代谢和自我更新机制,在生物发育过程以及维持机体稳态中发挥重要的作用。自噬发生标志是双层膜自噬小体的形成,将胞质内衰老的细胞器、蛋白质和生物大分子等包裹,再与溶酶体融合形成单层膜的自噬溶酶体,溶酶体酶对其中的包裹物质进行降解,为细胞及细胞器的重构、再生与修复提供原料,实现细胞内物质的循环与再利用。越来越多的证据表明,自噬在许多人类疾病中发挥复杂的调控作用。其中miRNA通过靶定重要的自噬相关基因,对自噬的调节发挥重要的作用。miRNA作为一种长度在18-22个碱基的非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA的3’UTR区完全或部分互补结合,降解靶mRNA或抑制其翻译。已有研究表明,miRNA可通过抑制自噬相关基因的表达从而调节细胞自噬水平,参与许多疾病如癌症、神经退行性病变等疾病的发生发展。目的：(1)建立矽尘诱导小鼠肺纤维化模型,对小鼠肺组织中自噬活性与miR-449a水平进行检测,在成纤维细胞模型中进行验证。明确自噬活性在矽尘诱导小鼠肺纤维化组织中的变化(2)使用miR-449a mimic与转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1处理成纤维细胞,同时使用agomiR-449a处理矽肺动物模型,来进一步证明miR-449a与自噬活性在矽尘诱导肺纤维化发生发展中的关键作用。(3)结合相关文献报道及生物信息学网站分析,预测miR-449a作用的自噬相关靶基因,并对其进行验证。期望从自噬和miRNA的角度揭示矽肺的部分发病机制,最终为矽肺的预防、早期诊断与治疗提供线索。方法：(1)矽尘诱导的小鼠矽肺模型的建立：暴露气管,一次性直接灌注Si02粉尘悬液的方式建立小鼠肺纤维化模型,通过不同时间点(0、7、14、28天)肺组织病理切片HE染色观察Si02粉尘诱导小鼠矽肺发生发展的动态变化过程。(2)使用qRT-PCR险测矽尘处理不同时间点小鼠肺组织中miR-449a的表达改变,Western Blots检测自噬标志物LC3与p62的改变情况。(3)使用TGF-β1处理成纤维细胞构建肺纤维化体外模型,qRT-PCR检测miR-449a的表达改变,使用Western Blot检测自噬标志物LC3与p62的蛋白表达情况。(4)使用agomiR-449a联合矽尘构建矽肺小鼠模型,病理切片HE染色观察小鼠肺组织的纤维化程度,qRT-PCR检测]miR-449a的表达改变,使用Western Blot检测自噬标志物LC3与p62的蛋白表达情况。使用miR-449a mimic转染联合TGF-β1处理NIH-3T3与MRC-5细胞,使用Western Blot检测自噬标志物LC3与p62的蛋白表达情况,免疫荧光检测p62的表达,转染GFP-LC3质粒检测自噬活性,同时使用透射电镜观察NIH-3T3细胞中自噬小体数目的改变情况。(5)进一步通过查阅文献并结合miRDB、 TargetScan、PicTar、DIANA-microT等生物信息学软件找出miR-449a的自制相关的靶基因Bc12,并使用Western Blot和荧光素酶报告基因的方法进行验证。(6)Western Blot检测TGF-β1处理后,Western Blot检测ERK1/2的磷酸化水平。结果：1.小鼠矽肺组织中miR-449a:表达下降,自噬活性受到抑制：病理切片HE染色显示,在Si02粉尘处理的第7天,即可见肺泡内有明显的炎性细胞聚集,第28天时可见大量的葱皮样矽结节存在,肺组织广泛纤维化。qRT-PCR检测发现0、7、14、28天小鼠肺组织中miR-449a的水平逐渐下降。使用Western Blot检测发现0、7、14、28天小鼠肺组织中上皮标志物E-Cadherin表达逐渐下降,I型胶原(CollagenI)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin)、波形蛋白(vimentin)、p62的表达逐渐增加,LC3Ⅱ/LC3I的比值逐渐下降。说明随着矽肺的发生发展,小鼠肺组织中miR-449a的表达及自噬活性均受到抑制。2. TGF-β1可抑制成纤维细胞自噬：miR-449a的表达：使用不同浓度(0、1、2、5ng/ml)TGF-β1处理小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3)和人正常胚肺成纤维细胞系(MRC-5)处理24小时,或使用2ng/ml TGF-β1处理NIH-3T3和MRC-5细胞系不同时间(0、12、24、48小时),发现vimentin、fibronectin和p62的表达水平随着TGF-β1处理的浓度和时间而逐渐增加,而LC3Ⅱ/LC3I的比值则逐渐下降。使用2ng/ml TGF-β1处理两种细胞系48小时后,用qRT-PCR检测miR-449a的水平较对照组显著下降。说明使用TGF-β1构造的肺纤维化体外模型中,自噬活性与miR-449a的水平与体内试验的结果一致,均受到抑制。3.高表达miR-449a可抑制SiO2诱导的小鼠肺纤维化：在矽肺模型中观察到,高表达miR-449a组小鼠肺组织病理切片与单纯Si02处理组相比,肺纤维化评分明显降低,差异具有统计学意义。肺组织中的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和vimentin较单纯Si02处理组相比显著下降。自噬标志物p62的表达下降,而LC3Ⅱ/LC3I的比值上升。提示miR-449a能显著降低肺纤维化的程度,其机制可能与自噬有关。4. miR-449a能增加成纤维细胞的自噬活性：体外实验的结果显示,高表达miR-449a之后,NIH-3T3与MRC-5的Collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin与vimentin的表达均下降,自噬标志物p62的表达下降,LC3II/LC3I的比值上升。免疫荧光结果显示,转染miR-449a后p62的表达下降。转染GFP-LC3质粒后发现,高表达miR-449a后NIH-3T3细胞中绿色荧光斑点数目增加,表示细胞自噬活性增加。激光共聚焦实验结果显示,高表达miR-449a后NIH-3T3细胞内自噬小体的数目显著增加。这些均提示miR-449a能增加成纤维细胞的自噬活性。5. miR-449a通过靶向作用于Bc12增加细胞自噬：应用多种生物学软件预测miR-449a作用的靶基因,发现在Bc12的3’UTR区存在miR-449a种子序列的结合位点,提示Bc12可能是miR-449a的靶基因。进一步用双荧光素酶报告基因实验来验证,转染miR-449a后,NIH-3T3细胞的Bc12蛋白水平下降,显示同时转染miR-449a mimic与Bc12野生型质粒后,荧光活性较同时转染miR-449a mimic与Bc12突变型质粒相比显著下降。提示Bc12是miR-449a的靶基因。6.TGF-β1通过ERK信号通路抑制Bcl2的降解：Bcl2的蛋白水平随着TGF-β1处理的浓度和时间的增加而逐渐增加。Western blot实验结果显示,ERK1/2的磷酸化水平也随着TGF-β1处理的浓度和时间的增加而逐渐增加,提示TGF-β1通过ERK1/2信号通路抑制了Bc12的降解,从而使得细胞的自噬水平受到抑制。结论：在Si02诱导的小鼠肺纤维化的发生发展过程中,miR-449a随着肺纤维化的发展而逐渐下降,同时自噬活性受到抑制。高表达miR-449a后,小鼠的肺纤维化受到抑制,同时肺组织细胞自噬活性增加,使用TGF-β1处理成纤维细胞构建的纤维化体外模型验证了这一点。miR-449a通过其靶基因Bc12发挥调节细胞自噬活性的作用,自噬活性增加的同时可能抑制了成纤维细胞的增殖,从而发挥抑制肺纤维化的作用。TGF-β1通过激活ERKl/2信号通路,从而抑制了Bc12的降解,抑制细胞的自噬水平。这些结果均提示miR-449a负调控Bc12的表达,影响了肺成纤维细胞的自噬水平,从而影响了肺纤维化的发生发展。