研究背景肠结核(intestinal tuberculosis，ITB)是由结核分支杆菌感染引起的肠道特异性感染性疾病,是最常见的肺外结核之一,主要因感染人型结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起,少数因进食未经消毒的乳制品或牛奶而感染牛型结核分支杆菌(Mycobacterium bovis)引起；克罗恩病(crohn’s disease,CD)是一种病因尚未明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病,其发生可能是遗传与环境共同作用的结果,可以累及从口腔至肛门整个消化道任何部位。肠结核与克罗恩病是两种病因完全不同的疾病,但均可导致肠道慢性肉芽肿性改变,两病在临床表现、内镜特点,组织病理学特征等方面十分相似,缺乏特异性诊断指标,临床上鉴别困难,有报道两者相互误诊率达50-70%。由于病因、治疗方案及预后截然不同,当两病发生误诊时将会导致严重后果。当肠结核被误诊为克罗恩病时使用免疫抑制剂治疗将引起结核扩散,甚至危及患者生命；而当克罗恩病被误诊为肠结核时使患者承受不必要的抗结核治疗药物的毒副作用,同时延误原发病的治疗可能引起原可以避免的并发症发生。因此,准确鉴别肠结核与克罗恩病十分必要。正常情况下,组织损伤后有再生和纤维性修复两种方式,两种过程保持动态平衡,维持着肠道正常的结构和功能。肠结核与克罗恩病均引起肠道长期慢性炎症,目前推测,肠道长期慢性炎症刺激导致肠道组织损伤,释放大量炎性介质,刺激成纤维细胞等活化并在损伤部位聚集,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成增多,降解减少,过量细胞外基质的沉积可导致肠道纤维化的形成。因此,肠道纤维化在肠结核与克罗恩病中均起着重要作用。在众多参与纤维化形成的蛋白中,转化生长因子β (TGF-β)是目前公认的最重要的致纤维化细胞因子,在肠道纤维化过程中起重要作用。在克罗恩病狭窄肠段中TGF-β表达明显增高,并与成人克罗恩病引起早期肠道切除术相关。目前有不少研究探讨克罗恩病中肠道纤维化形成的机制。相关研究提示克罗恩病相关的肠道纤维化可能与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关,表现为上皮细胞标志物表达减少,间质细胞标志物(如波形蛋白,vimentin)表达增加。纤维沉积在不同疾病中表现出不同的特征,如在克罗恩病中,纤维沉积可累及肠道全层,进而引起肠腔狭窄,而在溃疡性结肠炎中,纤维沉积一般局限在粘膜层及粘膜下层,很少导致肠腔狭窄。不同疾病纤维沉积的差异提示不同病因引起的肠道纤维化在程度及机制上也可能存在差异,比较不同病因所致的肠道纤维化程度及纤维化相关蛋白表达差异可能为鉴别不同疾病提供线索。因此,本研究拟通过比较肠结核与克罗恩病肠镜活检粘膜组织中总胶原纤维、Ⅰ型、Ⅲ型胶原沉积量及纤维化相关蛋白TGF-β、vimentin表达差异,探索这些指标在鉴别肠结核与克罗恩病中的价值,寻找鉴别两病的新方法。目的通过分析肠结核与克罗恩病患者肠镜活检标本胶原纤维及纤维化相关蛋白转化生长因子β(TGF-β)、波形蛋白(vimentin)在两者间表达水平差异,探索其在鉴别两病中的价值,寻找鉴别两种疾病的新方法。方法收集2006年1月至2015年6月在南方医科大学珠江医院确诊为肠结核、克罗恩病患者的肠镜活检标本,同时收集健康体检者的回盲部组织作为正常对照组,其中肠结核组15例,克罗恩病组19例,正常对照组15例。每例病理组织连续切片4张,分别行masson染色、免疫荧光双染色、免疫组化染色。采用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)分析图片,计算累积吸光度(Integral optical density,IOD),以IOD反应各指标表达水平,比较各指标在三组间表达差异,并采用受试者工作曲线(Receiver Operator Curve,ROC曲线)评价这些指标对鉴别两病的价值。所得数据均使用SPSS 19.0软件分析,P小于0.05认为差异具有统计学意义。结果肠结核组、克罗恩病组临床表现、内镜下及病理学特征比较肠结核组与克罗恩病组临床表现及并发症比较：在临床表现方面,腹痛、腹泻、体重下降在克罗恩病组较肠结核组多见,而发热、血便在肠结核组较克罗恩病组多见,但这些症状在两组间比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)；肠结核组合并肠外结核较克罗恩病组多,且差异具有统计学意义(P=0.028),克罗恩病组合并肠腔狭窄、肠梗阻、瘘管形成均较肠结核多,但两者比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。肠结核组与克罗恩病组内镜下表现及病理组织学特征比较：在内镜下表现方面,假性息肉及鹅卵石征在克罗恩病中更常见,显著高于肠结核组(P<0.05),肠粘膜充血、糜烂、溃疡形成、纵行溃疡及粘膜桥形成在克罗恩病组中较肠结核组中多见,而回盲瓣受累、环形溃疡在肠结核组中较克罗恩病组中更常见,但这些指标在两病间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。在组织病理学特征方面,干酪样肉芽肿在肠结核组中发生率显著高于克罗恩病组,且差异具有统计学意义(P<0.05)；而肠粘膜慢性炎、肉芽肿形成、非干酪样肉芽肿、裂隙状溃疡在两者中比较无显著性差异(P值均>0.05)。Masson染色检测总胶原纤维在各组间表达通过masson染色法观察胶原纤维在各组间表达,在Masson染色中,胶原纤维呈蓝色信号。正常肠道组织中可观察到少量胶原纤维均匀分布于肠道各层中,肠结核组及克罗恩病组胶原纤维表达显著增高,交错排列于肠道各层中。各组间胶原纤维含量比较：(1)三组间总胶原纤维含量(正常组：6964.20±819.98；肠结核组：22093.53±1643.12；克罗恩病组：15200.42±1232.63)比较,差异有统计学意义(P<0.05)；(2)组间比较：a.在肠结核组与克罗恩病组中,纤维沉积量显著增高,总胶原纤维定量均显著高于正常对照组(P正常组VSITB组=0.000；PCD组vs正常组=0.000)；b.肠结核组与克罗恩病组比较,肠结核组总胶原沉积量显著高于克罗恩病组(P=0.007)；表明肠结核与克罗恩病均可引起肠道不同程度纤维沉积,且以肠结核引起肠道纤维沉积更显著。免疫荧光双染法检测Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维在各组间表达通过免疫荧光双染法观察Ⅰ型、Ⅲ型胶原在三组间表达,免疫荧光双染中,红色荧光为Ⅰ型胶原沉积信号,呈红色粗颗粒状；绿色荧光为Ⅲ型胶原沉积信号,呈绿色网状排列。各组间Ⅰ型胶原沉积量比较：(1)三组间Ⅰ型胶原沉积量(正常组3475.60±397.32;肠结核组：7086.13±948.45;克罗恩病组：4304.47±454.17)比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；(2)组间比较：a.Ⅰ型胶原纤维沉积量在肠结核组显著高于正常组及克罗恩病组(PCD组VSITB组=0.045；PITB组VS正常组=0.007)；b.克罗恩病组Ⅰ型胶原沉积量与正常对照组比较无显著性差异(P=0.440)。各组间Ⅲ型胶原沉积量比较：(1)三组间Ⅲ型胶原沉积量(正常组2684.80±328.82；肠结核组：17030.47±1697.28；克罗恩病组：11292.11±758.46)比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)组间比较：a.肠结核组与克罗恩病组Ⅲ型胶原纤维沉积量均显著高于正常对照组(PCD组vs正常组=0.000,PITB组VS正常组=0.000)；b.与克罗恩病组比较,肠结核组Ⅲ型胶原纤维沉积量显著增高(P=0.017)。表明肠结核与克罗恩病引起纤维沉积中纤维亚型存在一定差异,肠结核可引起Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维在肠道沉积显著增多,而克罗恩病引起胶原纤维沉积以Ⅲ型胶原纤维为主,且肠结核组Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维沉积均显著高于克罗恩病组。免疫组化检测TGF-β、 vimentin在各组间表达光镜下可见转化生长因子β (TGF-β)、波形蛋白(vimentin)阳性信号呈棕黄色颗粒,TGF-β在腺上皮及间质细胞中均有表达,vimentin主要在间质细胞中表达。各组间TGF-β表达强度比较：(1)三组中TGF-β表达强度在肠结核组最高(70327.80±15523.75),其次为克罗恩病组(67823.21±6302.86),正常对照组最低(21871.33±3229.77),三组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。 (2)组间比较：a.肠结核组与克罗恩病组TGF-β表达强度显著高于正常组(PCD组va正常组=0.000,PITB组vs正常组=0.023)；b.肠结核组与克罗恩病组TGF-β表达强度比较,差异无统计学意义(P=0.998)。各组间vimentin表达强度比较：(1)三组中vimentin表达强度在克罗恩病组最高(96885.84±7073.05),肠结核组次之(63583.40-10741.80),正常组最低(30959.80±3650.68),三组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)组间比较：a.肠结核组与克罗恩病组vimentin表达显著高于正常组(PCD组vs正常组=0.000,PITB组vs正常组=0.030)；b.与肠结核组比较,克罗恩病组vimentin表达显著增高(P=0.046)。ROC曲线分析各指标对鉴别肠结核与克罗恩病的价值以上实验结果表明,肠粘膜组织中总胶原纤维量、Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维量、纤维化相关蛋白vimentin表达水平在肠结核组与克罗恩病组间存在统计学差异。通过ROC曲线评价以上四项指标对两种疾病的鉴别诊断价值。曲线下面积(Area under the curve, AUC)反映诊断实验的准确性,当曲线下面积小于0.5时无诊断价值,曲线下面积在0.5-0.7时诊断准确性较低,在0.7-0.9时诊断准确性较高,在0.9以上时诊断准确性最高。ROC曲线分析结果显示,肠粘膜组织中总胶原纤维量、Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维量对肠结核与克罗恩病有一定的鉴别诊断价值。以肠结核为阳性事件,总胶原纤维定量ROC曲线下面积为0.807(P=0.002,95%CI0.661-0.953),其在截断值为16937处诊断指数最大,对鉴别两病的灵敏度为80.0%,特异度为78.9%,阳性预测值为75.0%,阴性预测值为83.3%；Ⅰ型胶原纤维ROC曲线下面积为0.751(P=0.013,95%CI0.5890.913),其在截断值为4392处诊断指数最大,对诊断两病的灵敏度为86.7%,特异度为52.6%,阳性预测值为59.1%,阴性预测值为83.3%；Ⅲ型胶原纤维ROC曲线下面积为0.814(P=0.002,95% CI0.672-0.956),其在截断值11771处诊断指数最大,对鉴别两病的灵敏度为73.3%,特异度为73.7%,阳性预测值为68.8%,阴性预测值为77.8%。而vimentin表达强度的ROC曲线下面积为0.235(P=0.009,95% CI0.0590.411),对鉴别两病价值不大。结论肠结核与克罗恩病在临床特征、肠镜及病理表现非常相似,临床难以鉴别。两病均可引起肠道不同程度纤维沉积,肠结核肠粘膜组织中总胶原纤维量、Ⅰ型胶原纤维量、Ⅲ型胶原纤维量显著高于克罗恩病,这些指标对鉴别两病有一定价值,可能成为鉴别两者的新方法。