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目的恶性肿瘤是危害当代人类健康的严重疾病之一,肿瘤治疗方法包括传统的手术、放疗、化疗以及近年来兴起的基因治疗等。食管癌是全球第九大恶性疾病,在全球许多地区流行,特别是在发展中国家。中国是食管癌的高发地区,放射治疗是目前食管癌主要的、有效的、安全的手段之一。肿瘤的基因治疗是用一定的方法把外来的基因(DNA)转入肿瘤细胞中,使其在肿瘤部位表达高浓度产物或在体外相关细胞内重组后再导入体细胞中表达,抑制肿瘤恶性表型,选择性杀伤肿瘤细胞,对周围正常组织无明显毒副作用,达到控制肿瘤细胞生长的目的。放疗和基因治疗两者之间存在着相互增强的作用。其机理是射线照射后增加基因转染的效率和(或)促进基因的表达,另外基因转染后可增加肿瘤细胞对射线照射的敏感性。白细胞介素21(IL-21)是Julla等[112000年发现的Yc家族细胞因子成员,主要由活化的CD4+T细胞产生。IL-21与IL-2、IL-15和IL-4高度同源。Parrish-Novak[2]等研究者克隆了白介素21(IL-21)及其受体(IL-21R)的cDNA。人IL-21cDNA的ORF编码162aa多肽前体,其信号肽31aa,成熟蛋白131aa,推算其分子量15kD。本实验目的是通过含有IL-21基因的重组腺病毒载体(Ad-IL-21)转染体外培养的人食管癌细胞株EC109,观察IL-21基因的抑瘤效应,然后联合γ射线照射,研究两者的协同抑瘤作用,为食管癌的进一步基因治疗研究提供了理论基础和实验依据。方法本实验将已构建好的重组腺病毒Ad-IL-21基因于体外转染食管癌细胞株EC109,然后进行6Gy137Cs r射线照射,Ad-lacZ的病毒滴度为1.4×1012pfu/ml,重组腺病毒Ad-IL-21的病毒滴度为9×1011pfu/ml,感染率MOI值为100。实验分组设计为空白对照组、Ad-lacZ组和Ad-IL-21基因组、单独照射组和Ad-IL-21基因联合照射组(以下简称联合治疗组)。用MTT法和流式细胞术观察IL-21基因联合放疗对细胞生长及细胞周期、凋亡的影响。通过PCR及Western Blotting鉴定Ad-IL-21在转染食管癌细胞中的表达情况。结果1、食管癌EC109细胞生长曲线：空白对照组、Ad-lacZ组和Ad-IL-21基因组EC109细胞数量随培养时间延长呈增加趋势。转染后第2天开始,单独照射组和联合治疗组细胞生长明显缓慢,与Ad-IL-21基因组和Ad-lacZ组比较差异有统计学意义(F=145.269,P<0.05)；联合治疗组与单独照射组和Ad-lacZ组比较差异有统计学意义(F=98.907,P<0.05)。在转染后第3天,Ad-IL-21基因组的细胞生长开始明显比空白对照组和Ad-lacZ组慢(F=7.181,P<0.05),空白对照组与Ad-lacZ组相比差异无统计学意义(P>0.05),其中联合治疗组细胞生长最为缓慢。2.食管癌EC109细胞周期和凋亡的情况：流式细胞术检测结果显示,与Ad-lacZ组和空白对照组相比,Ad-IL-21组、单独照射组及联合治疗组EC109细胞停留在G1期的细胞增加,凋亡率增加。其中以联合治疗组G1期细胞所占比例最高,达到71.2%,凋亡率13.88%。3.食管癌EC109细胞内IL-21基因表达的变化：Ad-IL-21转染EC109细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增出预计的IL-21基因片段(493bp),以GAPDH为对照(300bp)。经Quantity one软件进行灰度分析,空白对照组、Ad-IL-21基因组、联合治疗组的IL-21基因相对表达量分别为0.16、0.34、0.39。Ad-IL-21组EC109细胞中IL-21基因表达量比空白对照组高,联合治疗组IL-21基因表达量最多,分别是Ad-IL-21组和空白对照组的1.1倍和2.44倍。4.食管癌EC109细胞内IL-21基因蛋白表达的变化：Ad-IL-21转染EC109细胞后提取总蛋白,Western blotting检测发现IL-21基因蛋白的特异性条带出现在Marker标准相对分子量15KD左右,以内参β-actin为对照,出现在42KD左右。利用灰度分析软件Quantity one对蛋白印迹带进行分析：空白对照组、Ad-IL-21组、单独照射组及Ad-IL-21联合治疗组IL-21的相对表达量为0.36、0.75、0.39和0.79。4个组均表达IL-21基因蛋白,Ad-IL-21联合治疗组IL-21表达量最高,Ad-IL-21组表达明显比空白对照组高。结论1.重组腺病毒Ad-IL-21能抑制食管癌EC109细胞的生长,通过与Ad-lacZ对照比较,表明对肿瘤细胞的抑制作用来自转导的IL-21基因,而不是腺病毒载体本身。2. Ad-IL-21组、单独照射组及联合治疗组对EC109细胞生长均有抑制作用,联合治疗组具有协同作用,其抑制效应最强。Ad-IL-21组、单独照射组及联合治疗组阻滞食管癌EC109细胞周期于G1期,使细胞对射线更敏感,促进细胞凋亡,联合治疗组凋亡率最高,有效地抑制肿瘤细胞的生长。3.经RT-PCR及Western blotting检测发现,空白对照组、Ad-IL-21组、联合治疗组中的IL-21基因及蛋白表达量不同,重组腺病毒Ad-IL-21有效地转染进入细胞,并且在细胞中稳定表达,联合治疗组的IL-21基因及蛋白表达量最高,结果说明单独IL-21基因对食管癌EC109细胞的生长具有一定的抑制作用,而联合治疗组抑瘤效应最明显,有效地抑制肿瘤细胞的生长,为今后用于临床恶性肿瘤的治疗提供了一个新的治疗方案。