背景特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies, IIMs)是一组异质性的骨骼肌自身免疫性疾病,临床上以进行性肌无力伴骨骼肌炎症细胞浸润为特征。根据不同的临床及组织病理形态学特征,临床上将其分成3个亚型即多发性肌炎(polymyositis, PM)、皮肌炎(dermatomyositis, DM)和包涵体肌炎(inclusion-body myositis, IBM)。由于PM和DM对皮质类固醇及其他免疫抑制剂有良好疗效,因此二者及时准确的诊断对于患者的治疗乃至预后非常重要。与DM中的特征性皮疹或病理上的束周萎缩特征能够有助于其早期识别和诊断不同,PM的及时正确诊断一直是临床上神经科和风湿科的难题。虽然迄今为止已有多种不同的诊断标准被提出,但对于DM和PM,大多数医生和研究机构仍然采用Bohan和Peter 1975年所提出的诊断标准。这一诊断标准主要是以临床表现和普通组织病理为基础,其中炎细胞的浸润在PM的诊断中占据重要地位。然而由于取材的局限性或在活检之前已经服用激素等免疫抑制剂治疗等原因,炎症细胞的浸润并不经常存在,因此常常影响PM的诊断以致漏诊。另外,在一些类型的肌营养不良,例如面肩肱型肌营养不良(facialscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)和dysferlinopathies中常有继发性炎细胞浸润,病理上与PM非常相像,以至容易造成误诊。此外,也不能将PM和因为取材局限性的原因而致病理上未发现镶边空泡(rimmed vacuole, RV)的IBM鉴别开来。近年来,随着对DM和PM发病机制研究的深入,逐渐认识到两者在免疫病理机制方面存在显著的差异。建立在免疫病理和分子病理基础上的研究表明,Bohan和Peter提出的诊断标准存在明显的缺陷。有鉴于此,2003年Dalakas和Hohlfeld总结近年来IIMs的免疫学研究进展,首次将这种免疫病理特征方面的差异应用到以免疫病理为基础的PM和DM诊断新标准中。该诊断标准凸出了检测主要组织相容性抗原I类分子(MHC-I)的重要性,并首次引入了术语CD8/MHC-I分子复合物(CD8/MHC-I complex),特指CD8+T淋巴细胞侵入MHC-1分子表达阳性的非坏死肌纤维,认为此种特征性损害表明骨骼肌炎症为原发性炎症,是PM的特征性免疫病理特征。虽然国内外已有多个针对MHC-1分子和／或MHC-II分子的表达检测在IIMs中的诊断价值研究,到目前为止,关于MHC-I分子的表达在IIMs中的诊断价值仍然存在相当大的争议,且没有一个明确的结论。是否仅仅根据MHC-I表达阴性即可排除IIMs的诊断或者MHC-I表达阳性即可确立诊断?另外,据我们所知,目前国内外尚无针对CD8/MHC-I复合物在PM中的诊断价值研究。与既往相关研究中常常将IIMs作为一个整体进行研究不同,本研究重点关注MHC-I分子和CD8/MHC-I复合物在PM中的诊断价值。我们首先探讨MHC-I分子在PM、DM、IBM、继发炎细胞浸润的肌营养不良以及类固醇反应性坏死性肌病这几类肌病中的不同表达特征,然后进一步评估CD8/MHC-I分子复合物对确诊PM的诊断价值。方法本研究为一回顾性病例—对照研究。病例来源为2004年9月至2008年12月期间在山东大学齐鲁医院神经肌肉病研究所进行肌肉活检的患者。我们选取了65例患者,分为五组。第一组为符合Bohan和Peter诊断标准的20例确诊PM患者,所有病例肌活检标本上均可见明显炎症细胞浸润。第二组为符合Bohan和Peter诊断标准的20例DM患者,其中均可见特征性皮疹和／或束周萎缩病理特征。第三组包括符合Griggs诊断标准的5例IBM患者,肌肉病理上可见明显的炎症细胞浸润及特征性的镶边空泡病理特征。第四组为10例肌活检标本上伴有炎症细胞浸润的肌营养不良,其中包括6例面肩肱型肌营养不良和4例dysferlinopathies。第五组为10例临床上怀疑PM的诊断,但病理上未见炎细胞浸润且血清自身抗体阴性的病例。根据其对皮质类固醇激素的良好反应,在排除其他常见坏死性肌病的病因之后,包括一些类型的肌营养不良、应用肌毒性药物、接触相关毒素以及横纹肌溶解等,诊断为类固醇反应性坏死性肌病(steroid-responsive necrotizing myopathy, SRNM)。另外选取10例有肌无力症状但肌活检病理正常,最终证实为其他系统疾病而非神经肌肉病的病例作为正常对照。采用免疫酶组织化学染色方法检测MHC-1分子在不同类型肌病中的表达,应用双重免疫荧光染色方法检测CD8/MHC-I分子复合物在IIMs中的表达。结果1.MHC-I分子在各组病例中的表达10例正常肌活检标本中仅血管内皮细胞表达MHC-I分子,而肌纤维本身不表达MHC-I分子。(1)PM.80%(16／20)PM肌活检标本中可见MHC-I阳性的非坏死肌纤维的存在,阳性纤维呈散在或小群分布,表现出局灶性表达模式。MHC-I阳性非坏死肌纤维的数量在10%至60%之间,染色程度为弱阳性(1+)或阳性(2+)。(2)DM：20例DM肌活检标本中均可见MHC-I阳性表达的非坏死肌纤维的存在,阳性率为100%。MHC-I在DM肌活检标本中呈弥漫性表达,几乎所有的肌纤维均表现为肌膜处MHC-I的强阳性表达(3+)。部分肌纤维尚可见胞浆MHC-I的表达,与仅肌膜处MHC-I表达的肌纤维相间分布,呈现马赛克样表达模式。另外在具有束周萎缩病理特征的DM病例中,尚可见束周萎缩肌纤维MHC-I阳性表达程度增强。(3) IBM：5例IBM肌活检标本中均可见MHC-I阳性表达的非坏死肌纤维的存在,阳性率为100%。MHC-I在3例IBM患者中呈弥散性阳性表达,另外2例类似PM,呈局灶性表达。阳性纤维的数量在两种不同表达模式的病例间差异较大,在10%至100%之间。(4)肌营养不良：伴有炎细胞浸润的10例肌营养不良病例中,6例(60%)肌活检标本上可见MHC-I表达阳性的非坏死肌纤维,其中包括4例面肩肱型肌营养不良和2例dysferlinopathies。MHC-I阳性的非坏死肌纤维在肌营养不良中呈散在分布,数量通常少于5%,阳性程度为弱阳性(1+)。(5)类固醇反应性坏死性肌病：10例类固醇反应性坏死性肌病中有5例肌活检标本上可见MHC-I阳性表达的非坏死肌纤维的存在,阳性率为50%。与PM相似,MHC-I在该组病例中也呈局灶性表达,表现为散在或小群分布的MHC-I阳性肌纤维,阳性纤维数量在5%至50%之间,阳性程度为弱阳性或阳性。2. CD8/MHC-I分子复合物在各组病例中的表达我们应用双重免疫荧光同时标记CD8及MHC-I分子以检测CD8/MHC-I分子复合物的存在。在20例确诊PM病例中仅4例(20%)可见典型CD8/MHC-I分子复合物。5例IBM患者中有3例(60%)可见到典型CD8/MHC-I分子复合物。而在其他组病例包括DM,伴有炎细胞浸润的肌营养不良以及类固醇反应性坏死性肌病中均未见到CD8/MHC-I分子复合物的存在。结论1.MHC-I分子在IIMs(尤其是PM)中的表达呈现出异质性,且不具有特异性,仅仅依靠MHC-I分子的检测不能够可靠地将PM与伴有炎细胞浸润的肌营养不良或类固醇反应性坏死性肌病鉴别开来。相反,由于其在DM中的表达较为一致,MHC-I分子的检测对于DM的诊断可能具有一定的价值。2.虽然CD8/MHC-I分子复合物在PM/IBM中具有较好的特异性,但由于其在PM中敏感性低且检测方法较为复杂,因此不是一个理想的PM诊断标记物。背景特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatory myopathies, IIMs)是一组异质性的骨骼肌自身免疫性疾病,临床上以进行性肌无力伴骨骼肌炎症细胞浸润为特征。根据不同的临床及组织病理形态学特征,临床上将其分成3个主要亚型即皮肌炎(dermatomyositis, DM)、多发性肌炎(polymyositis, PM)和包涵体肌炎(inclusion-body myositis, IBM)。DM被普遍认为是一种体液免疫介导的适应性免疫(adaptive immune)为主的自身免疫性疾病,以骨骼肌内大量B淋巴细胞和CD4+T细胞为主的炎症细胞浸润,抗体和补体介导的毛细血管损伤以及病理上的束周肌纤维萎缩为主要特征。PM和IBM则以自身反应性CD8+T细胞介导的细胞免疫为主,表现为CD8+细胞毒T性细胞侵入MHC-I表达阳性的非坏死肌纤维。虽然在以CD8+T细胞介导的细胞免疫反应为主的PM和IBM中,B淋巴细胞的浸润比较稀少,但近来基于基因芯片(microarray)技术的研究发现,PM和IBM患者肌肉组织中有大量免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)基因的转录,并且应用免疫组化的方法在PM和IBM患者肌活检标本中发现了大量浆细胞的存在。上述结果提示B淋巴细胞的浸润和激活不仅在DM也可能在PM和IBM发病机制中占有重要地位。为进一步明确B淋巴细胞在IIMs发病机制中的作用,Bradshaw等通过对BCR lgH链基因转录进行分析,发现在三种IIMs中1g均经历了亲和力成熟,证实了局部抗原驱动的B淋巴细胞的激活,从而认为局部抗原驱动的体液免疫反应可能是在三种IIMs中共同存在的一种免疫机制。临床上DM和PM患者中经常出现的自身抗体以及IBM患者中单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)的较高发生率均提示B细胞的异常激活与免疫球蛋白的产生可能在IIMs发病机制中占有一定地位。另外,临床上应用抗CD20嵌合型单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)清除B细胞治疗DM、PM和IBM有效也进一步证实了B淋巴细胞在IIMs发病机制中的作用。B细胞激活因子(B cell activating factor, BAFF)是近年来新发现的肿瘤坏死因子超家族成员,能够特异激活B淋巴细胞,促进B淋巴细胞的成熟及存活,诱导B淋巴细胞增殖、分化为浆母细胞,分泌自身抗体,介导抗原同种型转换(isotype switch)以及作为共刺激信号激活T淋巴细胞,调节T淋巴细胞应答。BAFF的表达异常,可刺激外周B淋巴细胞的增殖活化,延长自身反应性B细胞的生存时间、抑制细胞凋亡,延长浆细胞在组织中的生存时间,扰乱机体的免疫耐受状态,从而引发自身免疫性疾病。许多证据表明BAFF在自身免疫性疾病的发病机制中占有重要地位。研究发现过度表达BAFF的转基因模型小鼠能够表现出类似风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)以及原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)的症状。而在SLE、RA、pSS以及特发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpera, ITP)患者血清中也均发现了BAFF水平的异常升高,并且发现pSS患者血清BAFF水平同血清免疫球蛋白和自身抗体滴度相关。然而迄今为止,国内外尚鲜有BAFF分子在IIMs发病机制中的作用研究报道。临床上针对IIMs的治疗主要为大剂量长疗程的激素(强的松)应用,其中多数DM和PM患者表现出良好的疗效,而对IBM无效,目前对于这种疗效方面的差异尚无很好的解释。近来研究发现大剂量类固醇激素(地塞米松)能够下调BAFF在一些自身免疫性疾病(如RA、ITP)患者外周血中的表达,然而尚不清楚类固醇激素对于BAFF在IIMs患者体内的表达有无影响。本研究一方面在于明确BAFF在三种不同亚型IIMs中的作用有无差别,并探讨其在外周血和肌肉组织中的表达有无差异。另一方面通过对比治疗前后IIMs患者外周血BAFF的表达变化,以明确大剂量激素(强的松)能否下调IIMs患者外周血BAFF的表达,从而为IIMs的治疗提供新的干预靶点。材料和方法1.病例和对照本研究前瞻性收集IIMs患者21例,其中女性16例,男性5例,年龄在12岁至67岁,中位数年龄46岁。病例来源为2008年10月至2009年5月期间在山东大学齐鲁医院神经内科门诊及病房就诊的患者,所有入选IIMs病例,包括DM、PM和IBM均为符合临床诊断且经肌肉活检病理确诊的处于疾病活动期的病例,其中包括10例DM,9例PM以及2例IBM。所有入选病例在入组之初经临床和相关实验室检查后均予以排除重叠综合征、胶原血管病、恶性肿瘤以及同时合并有HIV、淋巴瘤、丙型肝炎等免疫功能异常的疾病,且入组之前均未应用任何免疫制剂治疗或之前应用过免疫抑制剂治疗但已停用6月以上。另外选取10例健康成人志愿者作为对照,其中女性6例,男性4例,年龄在21岁至65岁之间,中位数年龄45岁。2.治疗方案除2例IBM患者外,所有入选DM和PM患者在入组之初均予经验性强的松单药治疗,并随访相应治疗效果。参照文献记载并结合我们自己的经验制定下述具体治疗方案：强的松起始剂量1mg/kg/d,待4-6周后患者肌力改善和CK水平下降时开始减量,剂量以每周5mg递减,直至每日剂量达25-30mg为止,然后采用隔日用药方案。为了评估患者对大剂量(1mg/kg/d)强的松的治疗反应,我们在患者治疗4-6周后初次减量的时候通过评估肌力及CK水平两个方面的变化对患者进行疗效评估。3.分离血浆和外周血单个核细胞分别在入组之初和激素治疗后4-6周各留取EDTA抗凝血15ml。室温下离心分离血浆,然后用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。4.血浆BAFF水平的检测应用R&D公司人ELISA试剂盒检测血浆BAFF水平,检测下限为62.5pg／ml。5.外周血单个核细胞BAFF mRNA的表达使用TRIzol提取外周血单个核细胞总RNA,应用cDNA第一链合成试剂盒(Quantscript RT Kit)将mRNA逆转录成cDNA。采用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR,参照BAFF与β-actin的循环阈值(threshold cycle, Ct)的比值并通过公式2-△△Ct表示mRNA的相对水平。6.肌肉活检和免疫组化应用开放式肌活检术取材肱二头肌,标本经快速冰冻处理后,行常规HE以及BAFF分子免疫组织化学染色,同时应用CD3、CD4、CD8、CD20及CD68等单克隆抗体检测肌肉组织中的炎细胞分类及组成。结果1.治疗前血浆BAFF水平在DM和PM中升高,但在IBM患者中未见升高ELISA实验结果表明,同正常对照相比(767±171 pg／ml),DM和PM患者血浆BAFF水平明显升高(分别为3262±896 pg／ml和1713±463 pg／ml,P＜0.001),其中DM患者血浆水平升高程度较PM为著,差别具有统计学意义(P<0.001)。而两例IBM患者血浆BAFF水平未见明显升高,在正常对照上下限内。2.治疗前DM和PM患者PBMCs BAFF mRNA水平表达上调实时定量PCR结果显示治疗前DM患者BAFF mRNA的相对表达量在正常对照的1.87倍至4.89倍之间,而治疗前PM患者在1.02倍至2.45倍之间。BAFF mRNA的平均相对表达量在治疗前DM和PM中分别为正常对照的3.26倍和1.82倍。BAFF在DM中的表达水平高于PM(P＜0.001)。3.治疗前DM和PM患者血浆BAFF水平与PBMCs BAFF mRNA的表达相关应用Pearson相关分析,我们发现治疗前DM和PM患者血浆BAFF水平与外周血PBMCs BAFF mRNA的表达明显相关(r分别为0.74和0.91,P<0.001)。4.大剂量强的松能够抑制BAFF在DM和PM中的表达经过4-6周的大剂量强的松治疗后,DM和PM患者血浆BAFF水平较治疗前明显下降(932+422 pg／ml vs 3262±896 pg／ml,658±220 pg／ml vs 1713±463 pg／ml,P<0.001)。与之相对应,治疗后的DM和PM患者外周血单个核细胞BAFF mRNA的表达也明显下调,分别为治疗前的0.61倍和0.57倍(尸<0.001)。5.BAFF水平或含量的变化与强的松疗效具有一定相关性经过足量强的松治疗后,所有DM和PM患者血浆BAFF水平均明显下降,其中15例(78.9%)患者对激素反应良好,表现为部分缓解或完全缓解,另有4例患者(PM和DM各2例)对激素治疗反应不敏感。6.DM和PM患者肌肉组织BAFF表达阴性我们采用免疫组织化学的方法检测DM和PM患者肌活检标本中BAFF的表达。在DM和PM患者肌活检标本中包括肌纤维本身、血管内皮细胞以及肌肉组织中浸润的炎细胞均未见有BAFF的表达。结论1.BAFF在活动期DM和PM外周血中表达上调,且能够为大剂量强的松所抑制,提示DM和PM对激素反应良好的机制可能与激素能够抑制BAFF在两者外周血中的表达上调有关。2.IIMs患者外周血与骨骼肌靶器官在BAFF表达上存在差异,阻断BAFF外周血的表达可能为一新的DM和PM治疗作用靶点。