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锌指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein,ZAP)是通过高通量功能基因组筛选得到的抗病毒蛋白,能够抑制鼠白血病病毒、部分甲病毒属病毒和丝状病毒的复制。ZAP与靶病毒RNA特异性结合并招募Exosome实现对mRNA的降解,同时RNA解旋酶p72也有助于ZAP降解目标mRNA功能的实现。ZAP能够识别上述几种病毒RNA的特异性序列并抑制病毒的复制,通过对这些病毒特异性RNA序列的比较分析,没有找到明显的同源或者类似的结构域,初步判断ZAP是通过识别病毒RNA上的高级结构实现对病毒复制的抑制功能的。RNA的高级结构的基础是一级序列,本文通过体外系统进化SELEX(Systematic Evolutionof Ligands by Exponential Enrichment)方法研究ZAP在体外结合的RNA序列特点,并得到能与ZAP蛋白有高度特异性结合的RNA Aptamers。通过一级序列的多序列比对和二级结构预测得知它们是一组富含GU核苷酸并能形成stem-loop茎环结构的短RNA分子。在体外将它们通过α-32pUTP参入标记得到的探针能与免疫沉淀下来的ZAP蛋白特异性结合。将这些小的RNA分子克隆并插入报告基因的3UTR区域不能明显下调报告基因的表达水平,表明单一的结合位点不能引起ZAP介导报告基因mRNA的降解,也从侧面证明了ZAP必须通过结合病毒RNA上的多个位点才能抑制病毒的复制。同时我们利用RNA PolⅢ的H1启动子在细胞中高表达这些小的RNA Aptamer分子时,ZAP的功能有一定程度的下降,表明在体内环境中这些RNA分子能够通过结合ZAP蛋白,并影响ZAP蛋白降解mRNA功能的实现。
为了研究在体内情况下ZAP是否调节一些细胞内源mRNA的表达水平,我们通过基因芯片杂交的方法得到在NZAPZeo过表达的大鼠rat2细胞中,有一个表达序列标签ESTaa799740水平被下调。通过在大鼠基因组数据库中的比对,我们发现它位于一个预测未知基因cDNA的3端2.3kbps处。在使用特异性引物对rat2细胞cDNA文库的扩增时,发现EST AA799740存在于此未知预测基因的3UTR区域。通过RT-PCR、Northern杂交及报告基因表达实验证明此基因B3GTLmRNA水平受ZAP调控。