研究背景糖尿病已经成为全球的公共健康问题，在中国，有9200多万人患有糖尿病，其中2型糖尿病占90%以上。目前已知的2型糖尿病的发病机制一方面是β细胞难以补偿胰岛素抵抗效应，另外一方面是β细胞数量减少，β细胞数量减少和功能受损导致血糖难以控制及糖尿病并发症的发生。寻找一种能够减弱β细胞功能衰竭和/或提高分泌胰岛素细胞的数量的方法很有必要。恢复胰岛功能是医学界所期待和研究的方向。干细胞具有中、外胚层多向组织分化的能力，对于临床应用来说，骨髓干细胞很容易获取，因为它含有很多干细胞类型，尤其是间充质干细胞，它对改善β细胞生存和再生很有帮助。目前有大量的基础实验表明骨髓间充质干细胞对糖尿病有很好治疗效果。目前利用自体骨髓干细胞对2型糖尿病的治疗进入了临床应用前的研究阶段，采用自体骨髓干细胞移植的方法，将自体骨髓来源干细胞经血管介导注入体内以分化成新的胰岛样细胞，有望控制病情变化甚至治愈糖尿病。基于以上认识，我们开展了本项目研究，我们对自体骨髓间充质干细胞进行体外培养、扩增及鉴定，观察细胞的生长情况及形态；把分离的骨髓间充质干细胞不经任何诱导处理经血管介入定向移植到胰腺，观察移植后患者的血糖控制情况、胰岛功能及糖化血红蛋白的变化，以及观察是否存在不良反应。从临床角度上研究骨髓间充质干细胞对T2DM胰岛功能修复的能力，改善血糖控制的效果以及可能的不良反应。第一部分：成人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性鉴定目的：建立成人骨髓间充质干细胞体外分离、培养、扩增及鉴定的方法，并分析其生物特性，为进一步深入研究提供理论依据。方法：采取拟行骨髓间充质干细胞移植的2型糖尿病患者的骨髓200ml,经人类骨髓干细胞体外分离纯化试剂盒分离提取骨髓中的单个核细胞，在含10%FBS的DMEM-LG培养基中培养，结合间充质干细胞具有贴壁生长的特点，经过不断更换细胞培养液从而不断纯化分离BM-MSCs,并行体外扩增与培养。在倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞的一般形态结构及生长情况。描绘细胞生长曲线了解其生长特性。流式细胞仪检测CD34、CD44、CD45以及CD90的表面分子标记的表达情况。台盼蓝染色鉴定其活性。结果：骨髓间充质干细胞的原代细胞及传代细胞均呈梭形外观，细胞间成平行、漩涡状排列。原代细胞接种1-2天内观察出现贴壁细胞，5-9天细胞增殖速度增快，第10-12天时细胞融合成单层；传代细胞在3-6天增殖速度最快，第7-10天达到平台期。细胞表面标志物CD44、CD90表达阳性，CD34、CD45表达阴性。台盼蓝染色活性鉴定大于95%。第二部分：自体骨髓间充质干细胞对2型糖尿病的安全性及疗效评价目的：研究自体骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病的临床应用价值，评价对2型糖尿病的治疗效果，初步探讨自体骨髓间充质干细胞治疗2型糖尿病的机制。方法：选取第三军医大学附属新桥医院内分泌科住院符合纳入标准及排除标准的共18例患者，获得知情同意书后接受自体骨髓间充质干细胞移植治疗。①粒细胞集落刺激因子动员骨髓；②患者俯卧位腰麻，双侧髂后上棘多点穿刺，抽取骨髓血200ml，将采集的骨髓血进行干细胞分离；③经腹股沟动脉插管将干细胞注入胰背动脉和/或胰横动脉；④观察患者移植前及移植后FPG(空腹血糖)、2h-PG小时(餐后2小时血糖)、F-CP(空腹C肽)、2h-CP(餐后2小时C肽)、AUCC(C肽曲线下面积)、HbAlc(糖化血红蛋白)、BMI(体重指数)等指标的变化，并用统计学方法分析。同时观察有无并发症及不良反应。结果：18例患者(12男6女)，其中8例患者进行3月随访，5例患者进行6月随访，5例患者进行12月随访。①自体骨髓干细胞移植过程中及术后随访均未观察到不良反应，移植前后肿瘤标志物及血淀粉酶均正常；②术后随访3月、6月、12月随访糖化血红蛋白(HbA1c)较移植前不同程度下降，其中3月、6月统计学有显着差异；3月、6月、12月空腹C肽(FC-P)及餐后2小时C肽(2hC-P)较移植前不同程度上升。空腹C肽升高达到统计学意义。在3月、6月、12月随访时与治疗前相比AUCC升高(5.93±5.85vs7.26±5.73,3.8±1.6vs5.8±2.38,4.73±5.32vs7.64±4.68)。有1例患者在术后第一日出现低颅压综合征，平卧休息后临床症状缓解，无特殊不适。结论1.人类骨髓干细胞体外分离纯化试剂盒分离的人骨髓间充质干细胞，获得的细胞纯度高，扩增能力强。2.流式细胞仪检测分离培养的BM-MSCs高度表达CD44、CD90，但不表达CD34、CD45。3.自体骨髓来源干细胞移植治疗糖尿病的安全性较高，对2型糖尿病患者的胰岛功能可不同程度地改善。