目前基于CRISPR/Cas的核酸检测技术以其高特异性和高灵敏度,及实验设计简单的特点,在众多领域受到日益广泛的关注。已报道的方法主要利用的是某些Cas蛋白进行程序性切割后被激活的非特异性的反式切割活性。结合相关的核酸扩增技术,已开发出包括HOLMES、DETECTR和SHERLOCK等具有高灵敏度和高特异性的核酸检测方法。这些方法分别利用了 CRISPR系统Class 2 Type V的Cas12a蛋白对单链DNA的反式切割,及Type Ⅵ的Cas13蛋白对单链RNA的反式切割。利用这些方法做核酸检测时,核酸的扩增和信号的检测两个步骤是分离的,这增加了样品间交叉污染的可能。这里,我们对与Cas12a一样从属于CRISPR系统Class 2 Type V家族,且具有反式切割活性的一种耐热的Cas12b进行了深入研究,测定了其发挥反式切割活性所需的反应温度、对单双链靶标的偏好性、对PAM的依赖性以及对靶标核酸的检测极限。并以原长或截短的sgRNA作引导,测试了 Cas12b发挥反式切割对靶标的特异性要求,证实其特异性能达到单碱基的水平。同时我们发现该Cas12b可在较宽的温度范围内发挥反式切割活性。之后,结合能够在同样温度条件下发挥作用的环介导等温扩增技术,我们实现了在一个体系中同时进行扩增和检测的一步法核酸检测,称之为HOLMESv2。另外,我们还利用能同时以DNA和RNA作模板的DNA聚合酶扩增待测的RNA分子,大大简化了检测RNA样本的操作过程。