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内颖和外颖是单子叶禾本科植物的特有组织,形成锁合结构以保护花器官和颖果的发育,但调控内外颖细胞分化并形成锁合结构的分子机制鲜有报道。我室前期的工作利用RNAi技术获得编码水稻类受体激酶基因OsCR4降低表达的转基因株系,命名为OsCR4i株系。这些植株呈现出颖壳颜色变黑和结实率降低的表型。在此基础上,本论文对OsCR4在水稻内外颖发育中的作用进行了深入研究。首先,通过重复转基因的工作发现OsCR4i株系除了呈现上述表型外,还出现因内外颖发育异常造成锁合结构被破坏,形成颖壳开裂的表型;通过RT-PCR检测发现不同OsCR4i株系中只有OsCR4的表达被下调,其他相关基因的表达不受影响,而且OsCR4表达水平越低,小穗颖壳开裂的表型越严重;数据统计的结果表明颖壳开裂的小穗,其结实率明显降低。这些说明OsCR4的基因表达与颖壳开裂的表型呈负相关。用X-rays能谱仪对内外颖外表皮细胞的硅元素进行测定,发现OsCR4i株系的硅元素相对含量明显降低;叶绿素渗出实验表明OsCR4i颖壳的叶绿素渗出速度明显快于野生型。透射电镜观察表明OsCR4i株系内外颖表皮细胞的角质层和细胞壁形成都存在缺陷。但是我们没有找到引起OsCR4i株系内外颖颜色变黑的原因。对成熟的内外颖进行扫描电镜观察,发现Os CR4i株系内外颖的外表皮细胞的线性阵列还存在,只是在呈山脊状的特化细胞上出现肿瘤样大小不一、形状不规则的细胞;部分内表皮细胞也出现细胞因过度增殖而形成细胞粘连的现象;半薄切片也同样观察到内外表皮细胞异常增生的表型,但内外颖的内部细胞层没有受影响。进一步对OsCR4i株系内外颖的不同发育时期进行了扫描电镜观察,发现OsCR4i株系内外颖的原基形成和身份建立及锁合结构的形态建成都是正常的。内表皮细胞的过度增殖出现在锁合结构建成后的花药发育的Stage An8,而外表皮细胞的分化异常是从山脊状细胞开始特化时才出现的,相当于花药发育的Stage An9。到花药发育的Stage An10,内颖外表皮上过度增生的硅化细胞与其边界组织发生粘连致使内颖严重扭曲,联合内表皮细胞的异常分化致使锁合结构遭到破坏最终形成颖壳开裂的表型。RT-PCR检测基因表达和pCR4-GUS检测启动子活性的实验表明,OsCR4是一个遍在表达的基因,其在小穗中的表达量很高。GUS染色后的组织切片观察表明OsCR4在小穗发育早期的表达没有组织和细胞特异性,但是从Stage An9开始,OsCR4特异地在内外颖的内外表皮细胞表达,而且在外颖和内颖形成锁合结构的部位表达量很高。这与OsCR4发挥功能的时期和部位完全吻合,并进一步印证了 OsCR4通过控制内外颖的表皮细胞分化影响锁合结构的形态。亚细胞定位和体外激酶活性的实验表明,OsCR4是一个在质膜和胞质小体定位的可以自我磷酸化活性的激酶。这说明OsCR4可能通过介导某种信号调控内外颖的表皮细胞分化过程。为了寻找OsCR4胞外互作分子,用OsCR4的胞外域（OsCR4-ECD）从不同发育时期生殖器官的混合cDNA中钓到两个小蛋白:OsCIP（OsCR4 Interacting Protein）1和OsCIP2,两者均含有信号肽。OsCIP1被推测为转脂蛋白家族的成员,可以与OsCR4的胞外域全长和TNFR结构域互作,定位于细胞表面,并且翻译后加工形成两个肽段。OsCIP1在花药发育Stage An10的内外颖的表皮细胞和种子的背部维管组织中有强烈表达;OsCIP2被预测为种子储存蛋白家族的成员,与OsCR4的胞外域全长、7 repeats结构域和TNFR结构域都互作,定位在细胞表面和胞质囊泡中,不存在翻译后加工。OsCIP2在花药发育Stage An9的内外颖的微管组织中特异表达,在种子的背部维管组织中也有表达。对两个蛋白的深入研究将为OsCR4控制水稻内外颖表皮分化的分子机制提供新的线索。DIS1和DIS2两个蛋白的同源性高达83%,是水稻CrRLK1L家族的成员。我室前期的工作,获得一个DIS1和DIS2同时被干涉的转基因株系,被命名为edRi株系,植株呈现半矮化、花序短小、小穗数量大幅度减少、小穗和雌雄蕊严重败育的表型,这说明两个类受体激酶在水稻生殖生长的许多过程中发挥着重要的作用。两个基因由此被命名为DIS（Defective Inflorescence and Spikelet）1和DIS2。在此基础上,我们着重对两者在花药发育中的作用进行了深入研究。对DIS1和DIS2共干涉的edRi株系和两个基因单独突变体dis1-1,dis1-2和dis2不同发育时期的花药进行半薄切片观察,发现edRi株系从Stage An8到Stage An12会出现各种不同的表型:一部分花药呈现出花药壁内层以里的细胞不分化或者小孢子降解死亡的现象;其余的花药可以正常分化产生小孢子,但其中仍有一些花药在Stage An11因绒毡层,中层和内层的提早降解而使小孢子停滞在液泡期;另外一些可以发育到成熟期的花药,在Stage An12还出现因无淀粉填充而败育的花粉。单独突变体的表型较弱,只在花药成熟期出现小孢子降解和淀粉填充不完全的现象。这说明DIS1和DIS2在花药发育和花粉成熟过程中功能冗余的发挥作用。对pDIS1-GUS和pDIS2-GUS转基因株系进行GUS染色后的组织切片观察,发现DIS1和DIS2从花药发育早期Stage An6到Stage An9在花药壁和小孢子中重叠表达;在Stage An10两者的表达略有差异,DIS1主要在绒毡层表达,DIS2主要在中层表达;在花药发育晚期Stage An11和Stage An12,只在花药壁的内层和表皮层重叠表达,在成熟花粉中不表达。免疫组化检测两个蛋白的表达模式与GUS染色的结果一致。DIS1和DIS2的表达模式与其发挥功能的部位是一致的。这进一步说明水稻类受体激酶DIS1和DIS2在花药的发育过程中功能冗余地发挥着重要的调控作用。