甲型副伤寒沙门氏菌(Sallmoella paratyphiA)是引起副伤寒的主要病原菌之一,经粪口途径传播。群体感应是指细菌自身产生或者感知其他种属细菌分泌的一些信号分子,并感知自诱导物的浓度变化,来调节细菌群体行为的现象。SdiA蛋白为革兰氏阴性菌群体感应经典途径的受体,与群体感应调控细菌生物行为如形成生物膜、产生抗生素等有着密切的关系。为了研究sdiA在甲型副伤寒沙门氏菌的功能及其与下游的哪些基因参与群体感应。通过融合PCR与同源重组结合,将sdiA敲除构建缺失突变株,然后研究缺失突变株的一些生物学特性:包括生长状态、是否抗噬菌体、生物膜形成和对各种抗生素敏感性分析。将sdiA经pMD18-T过渡构建至pKT25,细胞毒性及自激活验证诱饵质粒的可行性。接着构建了甲型副伤寒沙门氏菌基因组文库,采用细菌双杂交的方法,筛选与SdiA相互作用的蛋白质。阳性克隆经测序、序列比对、读码框分析后确定靶蛋白。再通过c-Myc标签Co-IP验证诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用,最后,通过基因敲除的方法研究靶蛋白在红霉素外排中是否具有重要的作用。sdiA缺失突变株的构建及生物学特性研究结果表明:(1)siA基因缺失不影响甲型副伤寒沙门氏菌的生长状态;(2)siA基因缺失对细菌生物膜的形成没有影响,添加外源信号分子AHL后发现,合适浓度的AHL能够促进生物膜的形成,说明可能存在其他感知AHL的蛋白受体,而随着AHL浓度的升高,生物膜的形成能力不随着增强;(3)siA缺失突变株表现出明显的抗噬菌体LSPA1的现象,通过测定噬菌体对两种菌的吸附率发现,没有差异,说明突变菌产生抗噬菌体的现象不是通过阻止噬菌体的吸附这一过程造成的;(4)通过对野生菌和突变菌抗生素敏感性分析发现,两者均表现出红霉素的抗性,对环丙沙星敏感、四环素、氯霉素敏感。细菌双杂交筛选与鉴定结果表明:(1)构建的诱饵质粒,对宿主细胞没有毒性,不存在自激活现象;(2)获得了高质量、具有代表性的甲型副伤寒沙门氏菌基因组文库;(3)采用细菌双杂交系统,初筛到300多个蓝色单菌,再经过在选择平板M63上复筛得到200多个阳性克隆,经过提取混合质粒转入报告菌株BTH101的初次验证,得到60多个阳性克隆,将纯化的文库质粒与诱饵质粒共转BTH101的回复验证的得到30多个阳性克隆。(4)将回复验证为阳性的文库质粒送测序,经过序列比对、读码框分析得到正确的靶基因ybjZ,编码的蛋白为大环内酯类ABC转运通透酶/ATP结合蛋白MacB。相互作用验证及靶蛋白功能研究结果表明:(1)构建了诱饵His标签融合表达载体和靶c-Myc标签融合表达载体,并对诱饵蛋白和靶蛋白进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-bolt检测目的蛋白的表达,诱饵及靶蛋白均能以可溶性蛋白存在。(2)将细菌裂解液混合液进行Co-IP实验,结果表明SdiA蛋白与YbjZ蛋白存在相互作用。(3)敲除ybjZ并不能改变影响细菌对红霉素的敏感性。本研究中,初步探讨了 SidA在甲型副伤寒沙门氏菌中的功能,提示SdiA可能在细菌抗噬菌体方面具有一定作用。通过细菌双杂交系统筛选到与SdiA相互作用的蛋白质大环内酯类ABC转运通透酶/ATP结合蛋白MacB。其在大肠杆菌中具有外排14和15元大环内酯类抗生素的作用,单独缺失该基因并不会影响宿主的红霉素抗性。