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异种移植被认为是解决器官短缺的有效途径之一。猪与人类生理结构相似,是异种移植器官供体理想来源。人源化基因修饰猪到非人灵长类的异种移植临床前研究已取得显著进展,然而分子不匹配造成的凝血紊乱等问题是目前的主要障碍。血栓调节蛋白(thrombomodulin,TBM)和二,三磷酸核苷酸水解酶1(ENTPD-1,CD39)是存在于细胞表面的膜蛋白,TBM通过激活蛋白C抑制凝血,CD39通过降解ATP的方式抑制炎症和血小板凝集,两者在减少炎症的产生及调节凝血紊乱中均发挥重要功能。本研究旨在创建转人CD39和TBM基因的人源化基因猪,克服异种移植出现的凝血紊乱。利用猪血栓调节蛋白启动子(p TBM)调控人TBM(h TBM)表达,通过体细胞核移植技术创建了表达h TBM基因小型猪。利用猪胰岛素启动子(porcine insulin promoter,PIP)调控人CD39(h CD39)表达,体外验证胰岛细胞特异性表达。研究结果如下:1、猪血管内皮特异启动子p TBM调控h TBM基因的表达载体构建及验证。采用基因抓捕的方法获得了7kb和9kb猪血栓调节蛋白启动子,分别构建表达1.7kb h TBM载体p7K(p TBM)-h TBM和p9K(p TBM)-h TBM。体外转染猪内皮细胞、耳成纤维细胞及肾细胞,RT-PCR显示7kb和9kb两种启动子都能特异调控h TBM在血管内皮表达;Western Blot显示9kb启动子的启动活性高于7kb(P<0.05)。2、转h TBM基因的克隆猪创建。将p9K(p TBM)-h TBM-Hyg载体转染猪耳成纤维细胞,潮霉素筛选获得58个单细胞克隆,通过体细胞核移植获得重构胚,移植1203枚胚胎到5头受体母猪。4头均妊娠,4头母猪共产仔10头,耳组织PCR鉴定10头仔猪均为阳性,22#仔猪死亡后的心、肝、肾、脾四种组织免疫组化显示血管部位均有表达。3、猪胰岛素特异性启动子PIP调控1.5kb h CD39基因的表达载体构建及验证。PCR获得1.5kb PIP启动子(包含第1外显子和第1内含子),构建了表达1.5kb h CD39的表达载体PIP-h CD39。体外转染MIN-6小鼠胰岛瘤细胞,RT-PCR检测显示PIP启动子能有效调控h CD39在胰岛细胞特异性表达,但Western Blot未检测到蛋白表达。综上所述,本研究成功构建了内皮特异性表达h TBM的载体,并获得表达h TBM的克隆猪,为今后克服异种移植分子不匹配引起的凝血紊乱奠定了基础。