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头颈鳞癌是人体常见恶性肿瘤,具有发病隐匿、侵袭性强、容易复发和转移以及预后差的特点。尽管近年来治疗技术不断进步,治疗后生活质量有所改善,但生存率并没有得到明显提高。头颈鳞癌死亡率高的主要原因是治疗抵抗、局部复发和远处转移,治疗抵抗和复发一直是头颈鳞癌治疗中的一个难点和尚未彻底解决的问题。深入研究头颈鳞癌的生物学特性、治疗抵抗发生的机理,是寻求更加有效的治疗手段,消除或减低头颈鳞癌治疗抵抗的关键所在。新近的研究证明,肿瘤的起源和生长可能是由肿瘤组织内少部分处于静止期,具有自我更新和分化能力的细胞群体所维持,由于这部分细胞具有干细胞特性,所以被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)。国内外学者已证明包括头颈鳞癌在内的多种肿瘤中确实存在CSC,这一事实为从CSC的角度研究头颈鳞癌治疗抵抗机理及改善治疗效果提供了新的思路和切入点。氧缺乏能够诱导一系列的细胞学、生理学及分子生物学变化,进而改变细胞的正常增殖、凋亡及损伤修复等进程。肿瘤微环境低氧这一因素被认为是包括头颈鳞癌在内多种实体恶性肿瘤产生治疗抵抗的主要原因,与肿瘤的治疗后复发、治疗效果差和不良预后直接相关。低氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)作为一种低氧依赖的核转录蛋白,是肿瘤组织供氧和供能的中心调控因子,是肿瘤适应低氧微环境和诱导相关基因表达并克服缺氧这一不利因素的中间环节,同时参与下游多个靶基因表达的调控,成为研究肿瘤微环境低氧状态的重要靶基因。肿瘤干细胞是肿瘤细胞中的一个亚群,与分化成熟的肿瘤细胞共处相同环境中,肿瘤生长局部微环境中的低氧状态使得CSC也必然生活于低氧微环境中。那么低氧微环境是否会影响CSC的增殖和分化,低氧微环境介导的治疗抵抗是否与肿瘤干细胞相关就成为我们的关注点。本项研究从低氧微环境和肿瘤干细胞入手,研究低氧微环境对喉癌hep-2细胞系中肿瘤干细胞增殖分化的影响及其机制,并进一步探讨低氧所介导的化疗抵抗与肿瘤干细胞的关系。第一部分低氧微环境对hep-2细胞肿瘤干细胞表型的影响目的:检测低氧微环境中hep-2细胞的CD133表型、增殖、凋亡、细胞周期及相关基因(HIF-1α)表达的变化,探讨低氧微环境对hep-2细胞肿瘤干细胞表型的影响,并进一步分析其相关机制。方法:1低氧及常氧环境培养hep-2细胞,流式细胞术检测常氧及低氧培养不同时间(6h、12h、24h、36h、48h)后细胞的CD133表型变化。2低氧及常氧环境培养hep-2细胞,MTT法检测细胞的增殖曲线。3低氧及常氧环境培养hep-2细胞,流式细胞术检测细胞的周期和凋亡情况。4软琼脂克隆形成实验检测低氧及常氧培养环境下hep-2细胞的克隆形成情况。5低氧及常氧环境培养hep-2细胞,RT-PCR法检测细胞中HIF-1αmRNA表达情况。6低氧及常氧环境培养hep-2细胞,Western blot法检测细胞中HIF-1α蛋白表达情况。结果:1 CD133在常氧及低氧环境下培养的hep-2细胞中均有阳性表达,常氧环境中培养的hep-2细胞中表达率为0.82±0.13%,而在低氧环境中培养表达率增高,在不同时间(6h、12h、24h、36h、48h)的表达率分别为1.41±0.11%、5.16±0.23%、2.43±0.15%、2.07±0.33%、1.05±0.23%。2经MTT法检测发现:低氧组hep-2细胞的增殖活性显著高于常氧组。3经流式细胞术检测发现:低氧组hep-2细胞的凋亡率显著低于常氧组的凋亡率,并出现明显的G0/G1期阻滞。4经软琼脂克隆形成实验检测发现:hep-2细胞在低氧环境培养克隆形成率较高,为15.63±3.15%;而常氧环境培养克隆形成率为9.34±2.46%。5经RT-PCR检测发现:低氧组和常氧组hep-2细胞的HIF-1αmRNA表达没有明显变化。6经Western blot检测发现:低氧组的HIF-1α蛋白表达较常氧组明显增强。结论:低氧微环境可以诱导和强化hep-2细胞的肿瘤干细胞特性,其作用可能与HIF-1α蛋白的表达变化相关。第二部分人HIF-1αRNA干扰质粒的构建及HIF-1α基因敲除hep-2细胞系的建立目的:建立人HIF-1αRNA干扰质粒,将其转染人喉鳞癌hep-2细胞,建立人喉鳞癌hep-2细胞HIF-1α基因敲除细胞系,并进一步分析该基因敲除细胞系中HIF-1α基因的表达变化。方法:1设计合成针对人HIF-1α基因的siRNA序列,退火后与pGPU6/Hygro质粒连接,构建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重组质粒。2采用脂质体法将重组质粒转染入人喉癌hep-2细胞,抗生素筛选出稳定转染细胞。3应用RT-PCR和Western blot方法检测HIF-1α表达变化。结果:1成功构建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重组质粒和人喉癌hep-2细胞HIF-1α基因敲除细胞模型。2经RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α基因在转录和蛋白质表达水平均有明显下降。结论:pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重组质粒能有效转染人喉癌hep-2细胞并下调HIF-1α基因的表达,为后续研究该基因的功能奠定了基础。第三部分HIF-1α基因敲除对hep-2细胞肿瘤干细胞表型的影响目的:检测HIF-1α基因敲除后hep-2细胞的CD133表型、增殖、凋亡、细胞周期的变化,探讨HIF-1α基因对hep-2细胞肿瘤干细胞表型的影响。方法:1流式细胞术检测hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞低氧培养不同时间(12h和24h)后细胞的CD133表型变化。2 MTT法检测低氧环境培养的hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞的增殖情况。3流式细胞术检测低氧环境培养hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞的周期和凋亡情况。4软琼脂克隆形成实验检测低氧培养环境下hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞的克隆形成情况。结果:1低氧环境下培养12小时和24小时的hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞中均有CD133阳性表达,其中hep-2细胞中表达率为5.16±0.23%和2.43±0.15%,而HIF-1α基因敲除后其表达下调,表达率分别约为1.86±0.15%和1.21±0.13%。2经MTT法检测发现:HIF-1α基因敲除后hep-2细胞的增殖活性明显降低。3经流式细胞术检测发现:HIF-1α基因敲除后hep-2细胞的凋亡率升高,并且G0/G1期阻滞变化不明显。4经软琼脂克隆形成实验检测发现:hep-2细胞在低氧环境中培养克隆形成率为15.63%,而HIF-1α基因敲除后克隆形成率降低,为11.96%结论:HIF-1α基因敲除能够削弱由低氧微环境所诱导和强化的hep-2细胞肿瘤干细胞特性,HIF-1α基因在低氧微环境诱导的hep-2细胞中肿瘤干细胞的富集具有重要作用,HIF-1α可能参与肿瘤干细胞的生长调控。第四部分HIF-1α在CD133+细胞增殖及顺铂杀伤中的作用目的:探讨HIF-1α在低氧培养CD133+细胞生长分化及DDP治疗抵抗中作用,并初步研究其作用机制。方法:1流式细胞仪分选hep-2细胞和HIF-1α基因敲除hep-2细胞中的CD133+细胞。2有限稀释法检测低氧培养CD133+细胞克隆形成情况。3 MTT法检测低氧培养DDP对CD133+细胞增殖抑制情况。4流式细胞术检测低氧培养CD133+细胞中相关基因表达情况结果: 1采用流式细胞分选术成功分选不同hep-2细胞中CD133+细胞2有限稀释法检测CD133+细胞克隆形成情况,低氧培养hep-2细胞中CD133+细胞克隆形成率较高,为85.35±3.34%;而HIF-1α基因敲除后CD133+细胞的克隆形成率降低,为50.43±5.12%。3 MTT法检测低氧培养顺铂对不同CD133+细胞的增殖抑制情况,发现顺铂对HIF-1α基因敲除hep-2细胞中CD133+细胞的增殖抑制作用较强。4利用流式细胞术检测低氧培养hep-2细胞及HIF-1α基因敲除hep-2细胞中CD133+细胞的相关基因(Oct-4、suvivin及p53)表达情况,hep-2细胞中CD133+细胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表达荧光指数分别为3.64±0.21、0.88±0.16和1.39±0.23;HIF-1α基因敲除hep-2细胞中CD133+细胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表达荧光指数分别为2.23±0.15、1.25±0.11和1.07±0.17。结论:低氧培养下hep-2细胞中CD133+细胞具有较强的增殖分化活性和DDP治疗抵抗能力,HIF-1α基因敲除后CD133+细胞的增殖分化能力和DDP治疗抵抗能力有所下降,伴随着Oct-4、p53和Survivin表达变化。HIF-1α参与调控低氧微环境下肿瘤干细胞的增殖分化和DDP治疗抵抗,HIF-1α还可以通过调节Oct-4、p53和Survivin,进而发挥其调控作用。