背景和目的:放射作为一种高能物理损伤因素,主要通过放射能量积累的直接作用和辐解水分子产生活性自由基的间接作用,损伤生物大分子的正常结构和功能。DNA是放射损伤最重要的靶分子,DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)是放射诱导细胞死亡的最主要原因,DNA损伤修复反应(DNA Damage Response,DDR)通过复杂的级联反应网络控制细胞的DNA损伤修复、细胞周期阻滞以及凋亡,并最终决定细胞放射后能否存活。放疗主要通过电离辐射(ionizing radiation,IR)的直接或间接作用诱导DNA损伤尤其是DSBs杀伤肿瘤细胞。肿瘤细胞的放射敏感性和肿瘤微环境的保护作用是放疗效果的决定因素;而能否快速激活细胞周期检查点阻滞细胞周期并修复DNA损伤是影响肿瘤细胞放射敏感性的关键。骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是一种起源于间质细胞的最常见原发恶性骨肿瘤,也是典型的放射不敏感肿瘤。局部肿瘤控制对骨肉瘤预后至关重要,切除术仍是OS临床治疗的金标准;但对于不可手术或未能完全切除的OS,以及肿瘤切除术后带来的骨缺失及复杂的骨重建来说,放疗也是最重要的治疗选择之一。然而骨肉瘤具有较强的放射耐受性,高剂量放疗的效果仍然有限,且由此带来的副反应亦限制了放疗在OS治疗中的广泛应用。因此,研究骨肉瘤的放射耐受机制并鉴定新的分子靶标则有可能克服此障碍,实现局部肿瘤控制、拓展治疗窗并提高患者生存率和生存质量。骨肉瘤的放射耐受性与OS细胞在亚致死放射剂量下具有较强的修复能力有关。放射后细胞的修复能力与DDR的优先激活密切相关,抑制DDR则可提高肿瘤细胞的放射敏感性。已有研究证实,放射后抑制检查点激活相关的P21ras、Wee1或DNA损伤修复相关的NBS1都能有效提高骨肉瘤细胞的放射敏感性。放射损伤发生后,P21ras和Wee1通过抑制周期蛋白依赖性激酶2(Cyclin dependent kinase 2,CDK2)激活G1期检查点;而CDK2还可通过磷酸化NBS1的Ser432位点起始DNA修复。与CDK2的正常活化不同,放射诱导CDK2的Thr160磷酸化同时抑制Thr14和Tyr15位点的去磷酸化,分别参与NBS1 Ser432位点的磷酸化促进DNA损伤修复和G1检查点激活阻滞细胞周期,但其发生的分子机制尚未完全阐明。我们推测,放射后可能存在重要功能分子通过调控CDK2的磷酸化状态,平衡其在DNA修复和细胞周期阻滞中的双重作用。Crif1(CR6-interacting factor-1)是一个细胞生长和周期进程的负调控因子,含有核定位信号(Nuclear localization signal,NLS)和线粒体靶向序列(Mitochondrial targeting sequence,MTS)。我们的前期研究发现:Crif1可与CDK2相互作用将细胞周期阻滞于G0/G1期,参与白血病的化疗耐受;而在骨髓的间充质干细胞中,细胞的放射耐受性与Crif1表达水平升高有关。以上结果提示Crif1可能通过CDK2参与细胞的放射耐受。本研究中,我们证实Crif1在骨肉瘤中高表达,初步阐明其通过调控CDK2核转位和磷酸化参与OS放射抵抗的分子机制,并通过动物模型验证;有望为骨肉瘤的放射增敏提供新的研究靶点。方法:1.临床研究:收集2013年-2015年陆军军医大学第二附属医院骨科和陆军军医大学第三附属医院肿瘤中心确诊为骨肉瘤且经肿瘤切除术治疗的骨肉瘤组织标本及相应的癌旁非肿瘤组织13例,用于免疫荧光、Real-time quantitative PCR和Western blot检测Crif1的m RNA和蛋白表达水平。收集2013年-2014年陆军军医大学第二附属医院病理科和陆军军医大学第三附属医院病理与临床样本库的石蜡包埋骨肉瘤组织30例,免疫组化检测Crif1的表达水平并进行生存率分析。同时收集病人基本资料,包括年龄、性别、肿瘤发病部位、主要治疗方案、是否转移复发以及生存期等。2.分子机制研究:(1)Real-time quantitative PCR和Western blot检测骨肉瘤细胞(U2OS、HOS、Saos-2和K7M2)中Crif1的m RNA和蛋白表达水平。(2)以NT sh RNA(Non-targeting sh RNA)为对照组,在U2OS细胞转染sh RNA(sh Crif1)抑制Crif1表达后对细胞放射耐受性的影响:(1)Real-time quantitative PCR和Western blot验证Crif1的抑制效率;(2)CCK-8和细胞周期实验检测抑制Crif1对U2OS增殖和周期和的影响;(3)放射后,Annexin V和TUNEL检测细胞凋亡率;(4)放射后,检测抑制Crif1对细胞周期、细胞增殖、DNA复制、DNA修复、线粒体结构及线粒体膜电位的影响。(3)抑制Crif1表达对放射后CDK2亚细胞定位和激酶活性的影响:(1)免疫荧光检查放射前后Crif1和CDK2在细胞内的定位;(2)免疫共沉淀和GST-pulldown检测Crif1与CDK2是否存在相互作用;(3)在细胞放射后0、1、2、4、6、8、12、24 hr时间点Western blot检测CDK2、Cyclin E、CDK2-p T160、CDK2-p T14、CDK2-p Y15、NBS1、NBS1-p S432、Cdc25A等相关蛋白的表达;(4)细胞放射后各时间点分别检测细胞核内和胞浆内Crif1、CDK2、CDK2-p T160及CDK2-p T14的变化;(5)细胞放射后免疫荧光检测Ed U和γH2AX的阳性水平。3.动物实验研究:采用Balb/c nu/nu小鼠通过皮下注射U2OS-NT sh RNA和U2OS-sh Crif1细胞建立骨肉瘤动物模型。待肿瘤体积达到200 mm3时,荷瘤部位接受单次剂量为5 Gy的放射治疗。放疗后12小时,每组取3只裸鼠取肿瘤组织分别用于H&E染色、免疫组化和TUNEL实验。剩余裸鼠隔日测量肿瘤体积和体重至放疗后6周。结果:1.临床研究发现,骨肉瘤肿瘤组织高表达Crif1,其表达水平与患者生存率呈负相关。免疫组化结果表明,Crif1在骨肉瘤肿瘤组织中蛋白水平明显高于相应的癌旁非肿瘤组织;免疫荧光结果进一步证实Crif1在OS肿瘤组织中高表达且主要定位于细胞浆;13例肿瘤切除术OS标本中,与正常组织相比所有标本的Crif1蛋白均高表达,76.9%的标本m RNA高表达。有60%的石蜡包埋的存档骨肉瘤标本Crif1高表达,Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示高表达Crif1患者的生存率较差(P=0.030)。2.Crif1调节CDK2的活性促进骨肉瘤细胞放射抵抗。(1)Crif1在骨肉瘤细胞系中高表达。骨肉瘤细胞系(人骨肉瘤细胞系U2OS、HOS和Saos-2,小鼠骨肉瘤细胞系K7M2)中Crif1的m RNA和蛋白水平均高于非骨肉瘤肿瘤细胞(Hu H-7、A549、Jurkat和He La),与我们前期报道的高表达Crif1的骨髓间充质干细胞表达水平相近。(2)Crif1的高表达促进骨肉瘤细胞的放射抵抗。Annexin V和TUNEL实验结果表明,抑制Crif1的OS细胞在放射后凋亡比率显著增加。细胞遭受放射后,Crif1抑制细胞的S期比率和Ed U阳性细胞比率大幅增加,细胞活力下降;放射6 hr后,Crif1抑制细胞的γH2AX的阳性点显著高于对照组,DNA损伤修复延滞;另外,抑制Crif1还会加剧放射导致的线粒体碎片化和线粒体膜电位降低。(3)Crif1参与放射后CDK2的空间分布调控。Crif1与CDK2在骨肉瘤细胞胞浆中有一定程度的共定位;放射后可见Crif1与CDK2在细胞核中同步聚集。而抑制Crif1则会导致放射后定位于细胞核的CDK2明显减少。免疫共沉淀实验表明,Crif1与CDK2之间存在相互作用;GST-pulldown结果证实二者之间存在直接结合作用。(4)Crif1与CDK2的相互作用直接促进DNA损伤修复的效率。高表达Crif1的U2OS细胞在放射后可见CDK2 Thr160磷酸化增强并在细胞核内累积,NBS1 Ser432的迅速磷酸化,以及γH2AX的阳性点数在6 hr后逐渐下降。而放射后,抑制Crif1表达的细胞中,CDK2-p T160主要分布于细胞浆,且CDK2 Thr160和NBS1 Ser432的磷酸化增强被延滞,以及放射6 hr后γH2AX的阳性点数明显高于对照细胞。(5)Crif1与CDK2的相互作用参与G1检查点的激活为DNA损伤修复提供时间基础。高表达Crif1的U2OS细胞在放射后可见CDK2 Thr14磷酸化水平迅速增强并在细胞核中聚集导致细胞周期G1期阻滞。而放射后,抑制Crif1表达的细胞中,CDK2-p T14主要定位于细胞浆且磷酸化水平明显降低,大量未完全修复DSBs的细胞通过G1期检查点进入S期导致Ed U和γH2AX双阳性细胞比率显著增加。3.动物实验证实Crif1高表达促进骨肉瘤裸鼠模型放射抵抗。H&E染色证实骨肉瘤裸鼠模型的成功建立,免疫组化结果表明Crif1表达水平在U2OS-sh Crif1细胞形成的肿瘤中低表达。放疗后,肿瘤组织冰冻切片TUNEL实验结果显示,U2OS-sh Crif1组TUNEL阳性细胞数量显著增加。单独放疗仅能减缓肿瘤生长,抑制Crif1并联合放疗可导致肿瘤消退。放疗后6周,剥离肿瘤,U2OS-sh Crif1组肿瘤体积远小于U2OS-NT sh RNA组。结论:本研究证实Crif1通过调控CDK2的活性促进骨肉瘤的放射抵抗。细胞遭受放射后,Crif1介导CDK2的入核转运,一方面通过促进CDK2的Thr160磷酸化协助MRN复合物的形成直接参与DNA损伤修复;另一方面通过抑制CDK2的Thr14去磷酸化激活G1期检查点,为DNA损伤修复提供时间基础。在体外细胞实验和体内裸鼠模型中均证实,抑制Crif1的表达可增强OS的放射敏感性。我们的研究为寻找放射增敏靶分子,研究个体化治疗时间和剂量,克服骨肉瘤的放射耐受性提供了新思路。