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背景鼻咽癌是我国南方地区最高发的头颈部恶性肿瘤,其原发部位隐蔽,不易被早期发现,恶性程度高。放疗是鼻咽癌治疗主要的手段,尽管随着放疗技术的不断进步,鼻咽癌的治愈率较过去几十年明显提高,但是由于大部分鼻咽癌患者就诊时往往已伴有颈部淋巴结转移,甚至全身远处转移,这成为能否成功治疗肿瘤的最大障碍。鼻咽癌早期发生组织浸润和淋巴结转移的机制尚未明确,现代国内外学者已认识到肿瘤的发生发展是一个多因素、多基因、多阶段参与的复杂过程,并已开展许多基因学研究,旨在探索鼻咽癌发生发展的分子生物学机制,并试图寻找肿瘤防治的突破口。近年来大量表观遗传学研究已证实基因甲基化与肿瘤相关,越来越多的甲基化基因被发现不仅在鼻咽癌的发病机制中起重要作用,也在发展和转移中起重要作用,但是逐个基因甲基化改变的研究难以反映鼻咽癌表观遗传学的宏观改变。高通量全基因组甲基化芯片和表达谱芯片技术为多基因学研究提供了重要的技术支持,本课题拟应用以上两种技术联合筛选鼻咽癌颈部淋巴结转移相关基因,建立鼻咽癌颈部淋巴结转移相关基因甲基化谱,寻找鼻咽癌理想的基因标志物,从而为鼻咽癌的基因治疗提供新的靶位点。第一章鼻咽癌颈淋巴结转移相关基因甲基化谱的初步构建目的本研究应用NimbleGem人类全基因组甲基化芯片技术,筛选鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的异常甲基化基因,构建鼻咽癌颈淋巴结转移相关基因甲基化谱,为鼻咽癌侵袭、转移机制的深入研究提供理论依据。方法收集I期鼻咽癌(T1NOM0)石蜡标本和有颈部淋巴结转移的鼻咽癌新鲜组织标本(TxN1-3M0)各4例,分别提取样品DNA并质检合格,使用超声打断基因组后进行甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP),并扩增及纯化MeDIP,然后对样品进行荧光标记,标记后的样品与甲基化芯片杂交,采用高解析度芯片扫描仪检测芯片杂交信号,采用商用分析软件对杂交结果进行数据提取、标准化、峰值分析、报告。结果样品DNA质控均合格,包括提取的总DNA、超声破碎后DNA、免疫共沉淀甲基化DNA和荧光标记后DNA。基因甲基化芯片结果发现,4例I期鼻咽癌标本中有1134个基因均发生甲基化,而4例有颈部淋巴结转移的鼻咽癌标本中均发生甲基化的基因数目是835个；两组鼻咽癌标本中均发生甲基化的基因为396个。与4例I期鼻咽癌标本相比,在4例有颈部淋巴结转移的鼻咽癌标本中出现甲基化的差异基因为33个,33个基因散在分布于17条染色体上。另外,A组4例I期鼻咽癌标本均未出现甲基化而B组有颈部淋巴结转移的鼻咽癌标本中出现3例、2例和1例甲基化的基因数目分别为153个、658个和2340个。结论全基因组基因甲基化芯片筛选出33个鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的甲基化基因,初步构建了鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的基因甲基化谱,为鼻咽癌侵袭和转移机制的研究提供了新的候选基因标志物,为预防鼻咽癌的早期转移和复发提供了新的研究方向。第二章利用基因表达谱芯片技术筛选鼻咽癌颈淋巴结转移相关基因目的本研究应用NimbleGen人类全基因表达谱芯片技术,以早期鼻咽癌和有颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织标本为研究对象,筛选鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的差异表达基因,建立差异表达基因谱,并对差异表达基因进行生物学分析,从分子水平研究鼻咽癌发生颈部淋巴结转移的机制。方法使用TRIzol法提取6例早期鼻咽癌组织(早期组),8例有颈部淋巴结转移的鼻咽癌组织(转移组)的总RNA和6例正常鼻咽黏膜组织(正常组),对样品RNA进行纯化及质控,然后合成及纯化cDNA并标记,再将标记好的cDNA与NimbleGen基因表达谱芯片杂交、洗涤,经过芯片的扫描和数据采集及标准化后,筛选出两组鼻咽癌之间淋巴结转移相关的差异表达基因。结果20份样品总RNA提取结果良好,检测质量合格。我们筛选出与鼻咽癌颈淋巴结转移相关的差异表达基因共有6587个,其中表达上调的为3359个,下调的为3228个。上调的基因分布在1号(11.10%)、2号(7.62%)、17号(6.28%)染色体最多,在Y(0.21%)、21号(0.86%)、18号(1.28%)染色体最少。下调的基因分布在1号(10.19%)、19号(8.89%)、17号(6.85%)染色体最多,在Y(0.46%)、18号(1.02%)、13号(1.39%)染色体最少。GO分析结果显示表达上调的基因参与的生物过程(Biological Process)主要包括：细胞代谢过程(GO：0044237)、有机物代谢过程(GO：0071704)、初级代谢过程(GO：0044238)、病毒感染过程(GO：0016032)、细胞的应激反应(GO：0033554)氮化合物代谢过程(GO：0006807)等；其主要分子功能(MolecularFunction)包括蛋白质结合(GO：0005515)、有机环状化合物结合(GO：0097159)、杂环化合物结合(GO：1901363)、酶活性(GO：0003824)、离子结合(GO：0043167)、核酸结合(GO：0003676)等；其主要参与构成的细胞组分(Cellular Component)包括：细胞内组分(GO：0044424)、膜结合的细胞器(GO：0043227)、胞内细胞器(GO：0043229)、细胞质(GO：0005737)等。表达下调的基因参与的生物过程主要包括细胞过程的调控(GO：0050794)、刺激反应(GO：0050896)、细胞通讯(GO：0007154)系统发育(GO：0048731)、细胞间信号传递(GO：0007267)等；其主要分子功能包括受体活性(GO：0004872)、转运蛋白活性(GO：0005215)、核酸转录因子活性(GO：0001071)、通道活性(GO：0015267)、G蛋白偶联受体结合(GO：0001664)、受体激动剂活性(GO：0048018)等；其参与的细胞组分主要是膜组分(GO：0044425)、细胞外周(GO：0071944)、细胞外间隙(GO：0005615)、角蛋白纤维(GO：0045095)等。KEGG的生物通路富集分析(Pathway Analysis)结果显示3359个表达上调的差异基因中有1240个分别参与87条生物通路,例如病毒致癌作用(hsa05203)、EB病毒感染(hsa05169)、RNA转运(hsa03013)等；3228个表达下调的差异基因中有672个分别参与33条生物通路,例如细胞因子-细胞因子受体相互作用(hsa04060)、癌症异常转录(hsa05202)等。33个鼻咽癌颈淋巴结转移相关甲基化基因和3228个表达下调基因进行联合分析,筛选出了3个负关联的显著表达下调的差异甲基化基因：BAZ2B、CYP2J2和ZNF628,其中CYP2J2参与KEGG生物通路中的两条下调通路：亚油酸代谢通路(hsa00591)和卵巢类固醇生成通路(hsa04913)。3个差异甲基化基因主要参与转录调控,细胞核、内质网、微粒体的构成,和与DNA结合、蛋白质结合、离子结合等分子功能。结论本研究应用人类全基因表达谱芯片技术,筛选出与鼻咽癌颈部淋巴结转移相关的3359个上调和3228下调的差异表达基因,初步建立了差异表达基因谱,并对差异表达基因进行生物学分析,为研究鼻咽癌发生颈部淋巴结转移的分子机制提供了理论基础。对33个差异甲基化基因和3228个表达下调的基因进行联合分析,筛选出BAZ2B、CYP2J2和ZNF628三个负关联的显著表达下调的差异甲基化基因,为寻找鼻咽癌理想的基因标志物和新的治疗靶位点提供参考。