论文部分内容阅读
研究背景内膜新生是血管内膜层的异常生长,是一种常见的严重病理生理过程,是导致动脉粥样硬化和支架内再狭窄的主要原因。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是再狭窄和动脉粥样硬化病变中新生内膜的主要成分,其参与新生内膜形成的具体分子机制尚不完全清楚。目前认为,在损伤或其他刺激因素作用下,VSMC转化表型,增殖,迁移和分泌细胞外基质,导致新生内膜形成。在新生内膜形成期间,局部产生的生长因子,例如转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)也参与了该过程。目前,抑制新生内膜形成的防治手段仍非常有限。因此,进一步阐明控制VSMC生长调节的机制,对于理解此类血管增殖性疾病的发病机理和进程,并探寻治疗这些疾病新的分子靶标是非常必要的。转位蛋白(translocator protein,TSPO)是分布在线粒体外膜中的蛋白质。不同生物的TSPO蛋白在序列和功能上高度保守。在理化因素或致病因子的刺激下,细胞中TSPO的表达容易发生变化。TSPO在细胞凋亡,炎症,HIV生物合成,癌症和阿尔茨海默病中发挥重要作用。而TSPO参与多种心血管疾病过程的作用越来越受到研究者的关注,如心肌缺血再灌注损伤,心律失常,心脏肥大和动脉粥样硬化等。PK11195和Ro5-4864是两种被最广泛研究的TSPO配体。体外研究表明PK11195与富含巨噬细胞的人动脉粥样硬化斑块结合并大量聚集,放射性标记的PK11195已被用于动脉粥样硬化成像检测和疾病诊断。TSPO调控肿瘤细胞增殖的作用已被证实,且在动脉粥样硬化斑块区域TSPO表达显著上调,基于此,我们推测TSPO可能与血管成形术后VSMC的异常增殖有关。研究目的1、鉴定球囊损伤的大鼠颈动脉和PDGF-BB诱导的A10细胞的VSMC中TSPO的表达;2、研究TSPO在PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移中的作用;3、探讨TSPO配体对体外和体内VSMC增殖和迁移的影响和潜在机制。研究方法在成年雄性SD大鼠(250±50g体重)中,利用球囊损伤诱导建立左颈动脉内膜新生模型。分别在球囊损伤后1天,7天,14天和21天后处死大鼠并收集颈动脉标本。切片后行免疫荧光染色观察α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,a-SMA)和TSPO的表达;应用免疫印迹和PCR法检测TSPO蛋白和mRNA在颈动脉组织匀浆中的表达。在体外实验中,用PDFG-BB刺激A10细胞以诱导细胞增殖和迁移。用免疫印迹测定细胞裂解液中TSPO的表达;用细胞数计数和MTT法测定细胞增殖水平;用划痕实验和transwell法检测细胞迁移水平。利用质粒转染的方法进行功能获得性实验,探索TSPO在PDGF-BB介导的A10细胞增殖和迁移中的作用。应用TSPO特异性配体PK11195和Ro5-4864,观察它们对PDGF-BB介导的A10细胞增殖和迁移的影响,采用MTT,划痕实验和transwell等方法检测细胞增殖和迁移水平的差异。此外,我们用免疫印迹法测定了细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E,以及细胞增殖标志蛋白增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达情况。为了揭示TSPO配体抑制VSMC异常增生的作用机制,我们通过测定磷酸化AMP依赖的蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)与总AMPK的比值观察AMPK活性的改变,并应用AMPK特异性抑制剂Compound C进一步证实了AMPK信号通路在PK11195抑制A10细胞增殖和迁移中的作用。最后,我们在SD大鼠中研究了PK11195对球囊损伤诱导的内膜新生的保护作用。在大鼠颈动脉建立球囊损伤内膜新生模型的同时,给予腹膜内注射PK11195(3mg/kg,1次/3天)。在球囊损伤14天后,处死大鼠并收集颈动脉进行切片和HE染色,计算内膜与中膜的厚度比以评估新生内膜形成;利用PCNA免疫荧光染色评估VSMC增殖情况;利用免疫印迹法测定a-SMA的表达。结果细胞和动物实验均发现TSPO在异常增生VSMC中的表达明显上调;PKC/MAPK通路介导了PDGF-BB引起的A10细胞TPSO生成。过表达TSPO显著促进A10细胞增殖和迁移;相反,通过siRNA下调TSPO表达,以及TSPO配体PK11195或Ro5-4864(10ng/ml)处理,抑制A10细胞增殖和迁移。在机制研究中,我们发现PK11195能诱导AMPK活化;并且,AMPK特异性抑制剂Compound C消除了PK11195对PDGF-BB介导的A10细胞增殖和迁移的抑制作用。重要的是,给予大鼠腹膜内注射PK11195(3mg/kg,1次/3天),持续2周给药,能逆转球囊损伤引起的VSMC表型转换和增殖反应,从而减轻大鼠颈动脉内膜新生的严重程度。结论:TSPO是介导VSMC增殖和迁移的关键蛋白,PKC/MAPK通路介导了其增强表达的过程;TSPO特异性配体PK11195通过激活AMPK信号,逆转球囊损伤引起的VSMC表型转换,抑制VSMC的增殖反应,减轻球囊损伤诱导的大鼠颈动脉内膜新生。