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目的: 通过临床观察温阳补肾方治疗激素性股骨头坏死的疗效,并观察温阳补肾方含药血清对破骨细胞TRACP活性、Cathepsin-K、MMP-9、RANK基因及培养上清液RANK、RANKL的影响,探讨温阳补肾方对防治激素性股骨头坏死的机理。 方法: 1、本课题临床研究遵循随机对照原则,对37例激素性股骨头坏死患者进行临床观察,其中治疗组18例,对照组19例。治疗组给予温阳补肾方;对照组给予仙灵骨葆胶囊。服药同时辅助功能锻炼,并避免负重和长距离行走。分别于治疗前、治疗后对患者进行VAS、Harris评分并统计分析。 2、温阳补肾方含药血清制备:将60只Wistar大鼠随机分为4组(对照组、温阳补肾方低剂量组、中剂量组、高剂量组),每组15只。温阳补肾方低剂量组(4.35g/kg·d)、中剂量组(8.70g/kg·d)、高剂量组(17.40g/kg·d)、对照组用等量生理盐水灌胃。每日早晚各一次,连续灌胃7天。末次灌胃1h后,制备温阳补肾方含药血清,-20℃保存备用。 3、40ng/mL RANKL和20ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞,2d换液一次。每天用倒置相差显微镜动态观察培养细胞的形态及生长情况,TRAP染色鉴定破骨细胞。 4、各组加入温阳补肾方含药血清干预后,酶动力法测定各组破骨细胞上清液TRACP值。 5、实时荧光定量PCR检测温阳补肾方对破骨细胞Cathepsin-K、MMP-9、RANKmRNA表达的影响。 6、酶联免疫吸附法检测各组上清液RANK、RANKL含量 7、免疫组化法检测破骨细胞中RANK的表达。 结果: 1、临床观察结果示:温阳补肾方组和对照组均能增加Harris评分中功能评分,温阳补肾方组优于对照组(P<0.05),VAS评分、Harris其他各项评分的增加值及疗效方面组间未见明显统计学差异(P>0.05)。 2、40 ng/mL RANKL和20 ng/mL M-CSF诱导因子联合诱导RAW264.7细胞后,经 TRAP染色鉴定后,可获得成熟破骨细胞。 3、与空白对照组相比,温阳补肾方低、中、高剂量组在干预24h、48h时能使细胞上清液TRACP活性降低(P<0.05);中剂量组低于低剂量组、高剂量组(P<0.05);低剂量组与高剂量组(P>0.05)差异无统计学意义。TRACP活性随温阳补肾方低、中、高剂量组含药血清干预时间逐渐降低。 4、实时荧光定量PCR检测结果提示温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组可降低破骨细胞Cathepsin-K基因、MMP-9基因表达,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方中剂量组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。 5、ELISA法检测结果提示温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组培养上清液中RANK含量与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方高剂量组<中剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义(P>0.05)。温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组上清液中RANKL含量与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方中剂量组<高剂量组<低剂量组,三组组间差异没有统计学意义(P>0.05)。 6、免疫组化法提示温阳补肾方可减少RANK表达量,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方高剂量组<中剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。 7、实时荧光定量PCR检测结果温阳补肾方低剂量组、中剂量组和高剂量组可降低RANK基因表达,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方中剂量组<高剂量组<低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05);温阳补肾方中剂量组与高剂量组间差异没有统计学意义(P>0.05)。 结论: 1、温阳补肾方能有效改善激素性股骨头坏死患者的生活质量,减轻疼痛,疗效确切。 2、温阳补肾方能明显抑制破骨细胞活性。对破骨细胞性骨吸收的抑制作用与其降低TRACP活力值,减少Cathepsin-K、MMP-9 mRNA表达密切相关。中剂量组效果最佳。 3、温阳补肾方通过下调RANK mRNA和蛋白的表达,降低RANKL表达,减少RANKL与RANK的结合,抑制破骨细胞的活化,阻断其骨吸收活性的发挥。