鸡传染性支气管炎病毒属于冠状病毒科(Coronariyidae),为不分节段的单股正链RNA病毒。N蛋白进化上最为保守,主要与基因组核酸的包裹、RNA的复制和细胞免疫有关,含有大量抗原决定簇,免疫原性仅次于S蛋白,能诱导机体产生大量抗体。M蛋白及其基因在进化中比较保守,M蛋白与病毒的复制有关,同时M蛋白可能是重要的免疫原基因。尽管目前对于IBV的免疫大多数研究都集中于S1蛋白,但IBV其它的结构蛋白,如N蛋白、M蛋白与S蛋白相比保守性更高,因此研究N蛋白和M蛋白对了解鸡传染性支气管炎的诊断和防制方面有很重要的现实意义。通过表达具有高度保守性的N蛋白,并将其作为诊断抗原建立检测IBV抗体的ELISA法,为监测群体的抗体水平,预防和控制该病提供可靠的依据和有效的技术保障。同时表达M蛋白以便为下一步研究该蛋白的免疫原性奠定基础。本研究根据GenBank已报道的IBV的M41株的N基因和M基因序列分别设计一对引物,从提取的M41株的RNA中利用RT-PCR技术分别扩增获得了约1.23kb和678bp的片段,将这两个片段分别插入克隆载体pMD18-T,经测定核苷酸序列证实N基因和M基因都扩增正确,表明已成功构建pMD18-T-N和pMD18-T-M。再将pMD18-T-N和pMD18-T-M用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,将酶切后的N基因和M基因片段分别克隆到表达载体pET-32a中,分别转化入大肠杆菌Rossetta中,分别用IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示:其中N蛋白有了表达且为可溶性的蛋白,N蛋白有两种产物,大小分别约为63 kD和55kD,且Western blot检测可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应也出现两条带,表明表达的N蛋白有一定的生物活性;M蛋白也有表达,且也为可溶性的蛋白,条带约为30kD,Western blot检测可与相应IBV病毒抗体发生特异性的反应,说明表达的M蛋白有很好的免疫学活性。本研究在进行N蛋白的原核表达之后,用纯化的传染性支气管炎病毒(IBV)重组核蛋白(N蛋白)包被ELISA板,建立了检测IBV的间接ELISA方法,其中抗原的最佳包被浓度是1.80μg/ml,血清的最佳稀释度为1:80,二抗的最佳工作浓度为1:5000;统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.351 ( X +3×SD=0.18+3×0.057)。该方法特异性好,与其它禽类病毒(NDV、IBDV、EDS76V、AIV)标准阳性血清均无交叉反应;进行批间批内重复试验的结果是变异系数均小于8%,表明具有良好的重复性;用IDEXX试剂盒与本实验所建立的间接ELISA方法进行了符合性实验,结果阳性符合率为92.3%,阴性符合率为97.1%,说明此ELISA方法具有一定的可靠性;将其初步应用于80份血清的检测,结果表明本方法具有特异性强、灵敏度高、方便快速的特点,可用于临床样品中IBV抗体的快速检测。