论文部分内容阅读
羊奶中蛋白质、维生素、钙、矿物质、总脂肪含量高,羊奶所含的有益脂肪酸含量(如短、中链脂肪酸,不饱和脂肪酸和共轭酸等)均显著高于牛奶,羊奶中的乳脂代谢非常复杂,它受多种因素调控。Mi RNA(micro RNA)可通过调控其靶基因的表达影响脂肪酸代谢过程。本研究对奶山羊不同泌乳时期(泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期)乳腺组织进行mi RNA筛选后,对催乳素处理的乳腺上皮细胞做进一步筛选,发现6个表达差异的mi RNA。在此基础上,对这些筛选出来的mi RNA在功能、调控关系以及分子机制方面进行深入研究。得到如下主要研究结果:1.奶山羊乳腺组织mi RNA表达谱分析及乳脂代谢关键mi RNA筛选研究以奶山羊泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期的乳腺组织进行mi RNA表达量检测,基于mi RBase数据库提供的793条牛的mi RNA和267条羊的mi RNA进行第一轮的筛选,以p值小于0.05且差异在4倍以上为标准,筛选得到156个表达差异的mi RNA。随后使用与发动泌乳密切相关的因子——催乳素(2.5μg/ml)处理乳腺上皮细胞,进行第二轮筛选。发现mi R-30e-5p,mi R-15a,mi R-181b,mi R-148a,mi R-17-5p和mi R-135b这6个mi RNA在催乳素处理的乳腺上皮细胞中表达差异显著。2.Mi R-181b通过IRS2(Insulin receptor substrate 2)抑制TAG合成并调控Hippo信号通路基因在乳腺上皮细胞过表达mi R-181b可以抑制乳脂代谢,而抑制mi R-181b可以促进乳脂代谢。荧光素酶报告试验和Western Blot试验证明了mi R-181b的靶基因为IRS2。此外,在乳腺上皮细胞中,mi R-181b可以调控Hippo信号通路中的多个作用元件,如LATS1和YAP1。简而言之,研究发现mi R-181b通过调控Hippo通路上的多个元件及靶向IRS2抑制脂代谢。3.Mi R-30e-5p和mi R-15a通过靶向LRP6和YAP1基因协同调控乳脂代谢QRT-PCR和Western Blot试验证明了mi R-30e-5p和mi R-15a分别通过靶向Yes相关蛋白(YAP1)和LDL受体相关蛋白6(LRP6)来促进脂质分化。其中,mi R-30e-5p可以调控β-catenin基因,β-catenin进而介导YAP1的表达。在乳腺上皮细胞脂代谢中YAP1基因的m RNA和蛋白水平表达受mi R-30e-5p调控。此外,在乳腺上皮细胞中过表达mi R-30e-5p和mi R-15a可以促进脂代谢,与之相反抑制mi R-30e-5p和mi R-15a可以减少脂代谢。此外,mi R-30e-5p通过调控mi R-15a表达水平来协同调控YAP1在乳腺上皮细胞中的乳脂代谢功能。4.PRL通过甲基化修饰抑制mi R-135b功能QRT-PCR和Western Blot试验证明LATS2作为mi R-135b的靶基因来行使乳脂代谢功能。PRL处理乳腺上皮细胞时,对下调mi R-135b的表达有一定的时间和浓度梯度效果。此外,mi R-135b的5’端发现一个Cp G岛,通过调控Cp G岛的甲基化来抑制mi R-135b表达。进一步对PRL处理的乳腺上皮细胞中mi R-135b的功能和作用途径进行研究发现,DNMT I(DNA甲基化转移酶I)表达水平显著提高,而mi R-135b表达水平下调。此外,当mi R-135b的表达受到抑制时,LATS2表达水平上调。这就导致乳腺上皮细胞中乳脂代谢水平提高,从而行使维持泌乳等功能。5.Mi R-148a和mi R-17-5p通过PPARGC1A和PPARA基因协同调控乳腺上皮细胞乳脂代谢表达谱结果显示mi R-148a、mi R-17-5p、PPARGC1A和PPARA在泌乳盛期和干奶期中表达差异显著。荧光素酶和Western Blot试验发现,PPARA(脂肪酸调控重要因子)和PPARGC1A(调控脂代谢基因)分别是mi R-148a和mi R-17-5p的靶基因,而mi R-148a可以调控PPARA,mi R-17-5p可以调控PPARGC1A。过表达mi R-148a和mi R-17-5p促进甘油三酯(TAG,Triglyceride)的合成,而抑制mi R-148a和mi R-17-5p降低TAG的产生。重要的发现是mi R-148a和mi R-17-5p的协同作用促进了TAG的合成。即在乳腺上皮细胞中,mi R-148a与mi R-17-5p分别调控PPARGC1A和PPARA来协同完成TAG的合成,。本研究筛选的6个mi RNA及其靶基因对乳脂代谢的影响,为深入阐明奶山羊乳脂代谢调控机制提供了理论和试验依据,为解析羊奶脂肪酸成分形成机理奠定了基础。