第一部分：Beagle犬毒性试验中肾毒性生物标志物研究　　研究目的：　　随着新药的不断上市，临床上药物导致的急性肾损伤的报道越来越多，急性肾损伤作为药物的不良反应之一引起人们的广泛关注，然而在新药临床前肾毒性研究中，传统的肾损伤标志物，如血肌酐和尿素氮等的敏感性低和特异性差，不能较好的对新药潜在的肾脏毒性进行早期预测。因此，近年来，寻找并确证能够早期诊断肾脏损伤的生物标志物已经成为肾脏毒理学研究的发展方向。2008年6月，FDA和EMEA推荐了7个新型肾脏毒性生物标志物，但这些生物标志物的研究主要基于啮齿类动物，鉴于犬和人类的相似性高及犬在安全性评价中的广泛使用，肾毒性标志物在犬中却鲜有报道。本实验使用Beagle犬建立肾损伤模型，探索并寻找敏感性和特异性高的新型肾损伤标志物，为临床前药物肾毒性评价提供新的判断标准。　　研究方法：　　参考相关文献建立犬急性肾损伤模型，Beagle犬连续肌肉注射硫酸庆大霉素（80mg/kg）9天，以血清中传统标志物血肌酐（CRE）、尿素氮（BUN）及肾脏病理损伤为标准，建立肾毒性模型；对收集到的6h尿液样本检测肾损伤因子1（Kim-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、丛生蛋白(Clusterin)、白介素18(IL18)、骨桥蛋白(OPN)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿总蛋白(uTP)，血清进行半胱氨酸抑制酶 C(CysC)检测，采用受试者工作曲线方法将上述新的潜在肾毒性标志物与传统标志物血肌酐和尿素氮进行分析，找寻灵敏度和特异度都较优的新型肾毒性生物标志物；此外，在动物解剖时自膀胱采集解剖时间点尿液进行上述指标的检测，研究随机采尿时间点采尿方法用于评价肾毒性的可行性；同时提取肾脏组织 mRNA，在 mRNA水平对肾损伤标志物进行研究。　　研究结果：　　1、6h时间段尿中肾毒性生物标志物的研究　　与对照组相比，血 CRE、BUN、尿 NAG、clustrin、NGAL和uTP随着给药时间的延长，浓度呈升高趋势，有时间效应关系，且 NAG、clusterin、NGAL和uTP在早期就有显著性变化。　　血 BUN、CRE、尿 NAG、NGAL、uTP和clusterin的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.731、0.851、0.947、1.000、0.822和1.000。　　2、解剖点尿中肾毒性生物标志物的研究　　与对照组相比，uTP随着给药时间升高而升高，但无显著性变化，NAG于第3天就有显著性升高，NGAL于第6天有显著性升高，clustrin于第3天已有显著性升高，NAG、NGAL和clustrin的升高呈时间效应关系；　　血 BUN、CRE、尿 NGAL、clusterin、NAG和uTP的曲线下面积分别为0.827、0.920、1.000、1.000、0.907和0.947。　　3、相关标志物 mRNA水平的研究　　随给药天数的增加，Kim-1，clusterin，NGAL的mRNA表达倍数的增加，Kim-1在第3，6和9天相对于对照组的表达倍数分别是2.2倍，14.4倍和41.6倍，NGAL在第3，6和9天相对于对照组的表达倍数分别是0.45倍，5.32倍和5.42倍，变化最大的是clusterin，其在第3，6和9天相对于对照组的表达倍数分别是4.2倍，155.0倍和281.7倍。　　结论：　　1、研究表明，6h尿液样本中 NAG、NGAL、clusterin新型标志物相对于传统肾毒性标志物及肾脏病理变化结果，能在早期对急性肾损伤进行预测。　　2、随机时间点尿液中相关标志物也能够预测急性肾损伤，且采尿方法更为便捷。　　3、在庆大霉素诱导的犬急性肾损伤模型中，Kim-1的mRNA的表达逐渐升高，推测 Kim-1蛋白可能在 Beagle犬尿液中的含量也可能逐渐增加，可能作为评价犬急性肾损伤的潜在标志物，有待进一步研究。NGAL的mRNA并未出现立即升高的现象，与 NGAL蛋白在尿中的升高不一致，推测尿中蛋白的升高可能是已合成的NGAL蛋白释放所致。clusterin的mRNA的表达升高和尿中 clusterin蛋白升高相一致。　　第二部分：D青霉胺致Brown Norway大鼠自身免疫疾病模型的建立　　研究目的：　　建立 D青霉胺诱导的BN大鼠的自身免疫疾病模型，并研究模型中抗核抗体的发生、发展情况，为临床前抗核抗体检测方法的研究提供实验依据。　　研究方法：　　实验分为3组，D青霉胺对照组（灌胃给予450mg/kg D青霉胺），PolyIC联合D青霉胺给药组或联合给药组（灌胃给予450mg/kg D青霉胺前肌肉注射10mg/kg的PolyIC），去离子水组，每周给药6次，直到实验结束，从第二周开始，每周采血2次，进行抗核抗体检测，在 D青霉胺组抗核抗体产生时，D青霉胺组抗核抗体达峰时进行两次解剖，取心、肝、脾、肺、肾等进行病理学观察并称重，解剖前取血和收集尿液进行生化和尿蛋白分析，给药每天进行临床症状观察。　　研究结果：　　1、给药第12天起，联合给药组有动物出现耳红肿，耳缘增厚的症状，D青霉胺组从给药第13天起，部分动物出现耳红肿，耳缘增厚症状，并随着给药时间的延长，D青霉胺组及联合给药组患病动物数逐渐增加，症状加重，出现症状包括耳部和面部轻微溃疡，结痂，脚趾红肿等。　　2、各组动物在整个给药期间体重基本保持增长趋势，联合给药组动物体重在第5周时与对照组相比显著降低。首次解剖时（给药第15天），D青霉胺组和联合给药组脾脏重量与对照组相比显著增大。第二次解剖时（给药第31天），D青霉胺组出现心脏、脾脏、肺脏和肾脏重量的显著升高，联合给药组出现心脏、肝脏及脾脏重量的显著升高，胸腺重量显著减少。　　3、首次解剖时（给药第15天），D青霉胺组 ALP，LDH，CHO，ALB，Na+，CL-及联合给药组 AST，ALP，TBIL，Na+，CL-与对照组相比具有统计学差异；第二次解剖时（给药第31天），D青霉胺组 ALP、ALB及联合给药组 ALP，LDH，CRE，Na+与对照组相比有统计学差异。　　4、抗核抗体滴度的升高与自身免疫症状和病变的严重程度具有一致性。　　5、联合给药组出现自身免疫相关症状的时间早于 D青霉胺组且诱发的症状较 D青霉胺组来说更严重。　　结论：　　1、在国内首次建立 D青霉胺诱导 BN大鼠的自身免疫模型。　　2、D青霉胺在 BN大鼠和人体内均可诱发自身免疫疾病的发生，D青霉胺诱发的BN大鼠自身免疫疾病模型可用于毒性生物标志物、自身免疫的发病机制和药物临床前自身免疫研究的模型动物。　　3、抗核抗体有可能成为预测药物诱发的人体自身免疫的临床前毒性生物标志物　　4、PolyIC与 D青霉胺联用时，可增强 D青霉胺诱发的自身免疫反应。