Ca2+作为细胞内最为重要的第二信使之一,其浓度的变化可以引起一系列复杂细胞反应,对于细胞粘附、移动、扩增及基因表达等功能具有重要作用。钙信号对于人体多种生理功能广泛调节作用自发现以来已得到国内外研究人员极大关注。随着研究的深入,细胞内各个独立细胞器如细胞核、内质网、线粒体及溶酶体等的钙信号变化及相关调控机制已成为该领域近年来的研究热点;自1995年Gerasimenko等人发现核钙信号以来,关于核钙信号方面的调控研究一直存在争议,特别是核钙信号是否具有一套不依赖于胞浆钙信号的独立调控体系这一问题,一直未得到阐明。　　细胞核由核被膜及核孔复合物将其与细胞质分离形成一个相对独立的结构;通过核被膜钙泵、ryanodine受体、IP3受体以及核孔复合物,细胞核可以发挥自主调节钙信号能力,钙离子通过主动运输以及扩散进入或离开细胞核。核浆钙信号目前已被证实在细胞增殖、基因转录表达调节等方面发挥着重要作用。Rodrigues、Pusl等人研究证实核浆钙信号被抑制后,肝癌细胞或肝细胞系增殖被显著抑制,这可能与E1k1转录因子激活受阻有关。核钙信号也可以通过核因子NFAT影响基因转录,从而对后续一系列信号级联反应产生作用;同时CREB, DREAM等介导的基因转录激活亦依赖于核浆钙离子浓度升高。尽管人们对于核钙信号的研究越来越深入,但是对于是否存在不依赖于胞浆钙信号核浆钙信号现象以及相关调控机制仍然存在争议。目前研究人员发现可能参与到核浆钙信号调控机制的有IP3、ryanodine及NAADP受体,核浆网及钙调蛋白等,其中IP3、ryanodine及NAADP受体均被证明参与到核内钙库排空过程;核浆网与胞浆紧密连接,胞浆信号可通过其进入核内,且核浆网上存在有IP3及ryanodine受体,亦会对核浆钙离子浓度变化产生影响;而钙调蛋白与钙离子绑定是大多数钙离子介导细胞反应的必须步骤,且已发现钙调蛋白核转移现象,说明其可能参与到核浆钙信号调控过程中。　　本次研究通过TG刺激人脐静脉内皮细胞后,再给予不同外钙浓度平衡盐溶液,观察人脐静脉内皮细胞随外钙浓度降低,胞浆与核浆钙信号相对变化情况。研究发现胞浆钙信号随外钙浓度降低而降低,而核浆钙信号在达到一定阈值后独立于胞浆钙信号变化,不再降低;在较高外钙浓度条件下,其独立变化被胞浆钙信号变化所掩盖。这一实验结果是独立于胞浆钙信号调控的核浆钙信号调控存在的有力证据之一;研究进一步确定,在0.1mM外钙浓度条件下,可以进行独立于胞浆钙信号的核浆钙信号研究;在这一研究策略基础上,我们对于人脐静脉内皮细胞这一独立核钙信号调控机制进行了初步探索。已有研究表明,IP3受体及ryanodine受体可能参与到核浆钙信号调控过程中,故本次研究中使用IP3受体抑制剂heparin、XeC及ryanodine受体抑制剂ryanodine分别作用于细胞,观察处理后人脐静脉内皮细胞核浆与胞浆钙信号相对变化。研究结果显示ryanodine受体参与独立于胞浆钙信号调控的核钙信号调控机制,而IP3受体并未参与。已有研究对于独立于胞浆钙信号调控的核浆钙信号调控是否存在,以及核钙信号相关调控机制争议较多,本次研究结果为证实独立胞浆钙信号存在,进一步深入研究核钙信号调控相关作用机制提供了理论依据及新的线索。　　目的:本次研究旨在探寻胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号调控现象;确定独立研究核浆钙信号实验策略;探讨胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号相关调控机制,并为更深入的核浆钙信号调控研究奠定基础。　　方法:　　1.采用0.25％胰蛋白酶消化法原代及传代培养人脐静脉内皮细胞。　　2.胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号现象探索:首先TG(thapsigargin)刺激人脐静脉内皮细胞,再给予不同细胞外钙浓度(0.03mM/0.1mM/0.3mM/1mM/2mM) HBS溶液,通过共聚焦显微镜观察随细胞外钙浓度降低,核浆钙信号与胞浆钙信号相对变化情况,并进行统计学比较,观察是否存在胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号现象存在。　　3.胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号调控机制探索:在上步实验基础上,选用0.1mM细胞外钙浓度作为胞浆非依赖性核浆钙信号调控机制研究作用细胞外钙浓度,分别给予heparin、XeC及ryanodine处理,与给予同样处理2mM细胞外钙浓度作用下细胞胞浆钙信号与核浆钙信号进行统计学比较,以证实IP3受体以及ryanodine受体是否参与到胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号调控机制中。　　结果:　　1.人脐静脉内皮细胞TG处理后,胞浆钙信号随细胞外钙浓度下降而下降,组间比较差异有统计学意义(P<0.05,n=214);核浆钙信号在给予2mM,1mM及0.3mM细胞外钙浓度条件下随细胞外钙浓度下降而下降,组间比较差异有统计学意义(P<0.05,n=135);但在给予给予更低浓度(0.1mM Ca2+,0.03mM Ca2+)细胞外钙条件下,核浆钙信号与0.3mM细胞外钙条件下比较无明显变化,组间差异无统计学意义(P=NS,n=123)。　　2.heparin处理组:0.1mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,heparin处理组细胞核浆钙信号、胞浆钙信号与对照组比较差异无统计学意义(P=NS,n=84);2mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,heparin处理组细胞核浆钙信号、胞浆钙信号与对照组比较差异亦无统计学意义(P=NS,n=84)。　　3.XeC处理组:0.1mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,XeC处理组细胞核浆钙信号、胞浆钙信号与对照组比较差异无统计学意义(P=NS,n=80);2mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,XeC处理组细胞核浆钙信号、胞浆钙信号与对照组比较差异亦无统计学意义(P=NS,n=80)。　　4.ryanodine处理组:0.1mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,ryanodine处理组细胞核浆钙信号与对照组比较明显被抑制,组间比较差异有统计学意义(P<0.05,n=86),胞浆钙信号与对照组比较差异无统计学意义(P=NS,n=86);2mM细胞外钙条件下,给予TG处理后,ryanodine处理组细胞核浆钙信号与对照组比较明显被抑制,组间比较差异有统计学意义(P<0.05,n=86),胞浆钙信号与对照组比较差异无统计学意义(P=NS,n=86)。　　结论:　　1.在给予较高浓度外钙条件下,血管内皮细胞核浆钙信号独立变化被胞浆钙信号变化所掩盖;而较低细胞外钙浓度刺激时,核浆钙信号变化不依赖于胞浆钙信号;存在胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号现象,其调控独立于胞浆钙信号,具有自己独特的调控机制;同时确立研究独立于胞浆钙信号核浆钙信号调控机制实验研究方法,即TG刺激后,在0.1mM细胞外钙浓度条件下,观察对照组与受体抑制剂处理组细胞核浆与胞浆钙信号相对变化情况,确定胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号具体调控机制。　　2.IP3受体被特异性抑制剂抑制后,TG刺激后给予0.1mM及2mM细胞外钙条件下,核浆钙信号、胞浆钙信号与正常细胞比较均未受到明显抑制;证明其未参与到胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号调控机制中。　　3.ryanodine受体被特异性抑制剂抑制后,TG刺激后给予0.1mM细胞外钙条件下,核浆钙信号与正常细胞比较明显被抑制,而胞浆钙信号比较无变化;而给予2mM细胞外钙条件下,核浆钙信号、胞浆钙信号与正常细胞比较均未受到明显抑制;证明ryanodine参与到胞浆钙信号非依赖性核浆钙信号调控机制中。