目的：结肠癌发生机制目前还未明确，因此缺乏理想的治疗手段。钙周期素结合蛋白（Calcyclin-binding protein，CacyBP/SIP），是1998年发现的以Ca^2＋依赖的方式作为S100蛋白家族的靶蛋白。结构分析提示：CacyBP/SIP具有核定位信号；具有潜在的PKC磷酸化位点。功能研究表明：在结肠癌中，具有依赖Ca^2＋浓度的核转位及磷酸化现象，并促进癌细胞增殖。本实验通过构建CacyBP/SIP的丝/苏氨酸磷酸化位点的显性负性突变体，明确丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP在结肠癌细胞内定位的影响，以图揭示CacyBP/SIP核转位的分子机制，进而从源头上抑制结肠癌细胞增殖，为在分子水平上治疗结肠癌提供实验依据。方法：首先，通过基因克隆及基因重组等基因工程方法构建pEGFP-N₁-hCacyBP真核表达质粒。其次，通过磷酸化激酶数据库网站预测hCacyBP蛋白潜在的丝/苏氨酸磷酸化位点，以pEGFP-N₁-hCacyBP真核表达质粒为模板，采用PCR介导的定向突变方法，构建hCacyBP蛋白的丝/苏氨酸显性负性突变体。然后，将pEGFP-N₁空载，pEGFP-N₁-hCacyBP对照组质粒及其丝/苏氨酸磷酸化突变质粒分别通过脂质体介导方法瞬时转染入结肠癌SW480细胞中。最后，通过免疫荧光和激光共聚焦方法，观察hCacyBP及其丝/苏氨酸显性负性突变体在结肠癌细胞内的定位表达。结果：1.成功构建了pEGFP-N₁-hCacyBP真核表达质粒。2.通过磷酸化激酶数据库网站具体预测并筛选了9个hCacyBP蛋白的潜在丝/苏氨酸磷酸化位点。3.以pEGFP-N₁-hCacyBP真核表达质粒为模板，进一步成功构建了hCacyBP蛋白的9个丝/苏氨酸磷酸化显性负性突变体，分别为S3A，S34A，S48A，S137A，S141A，S142A，S180A，S188A，S217A。4.将pEGFP-N₁空载，pEGFP-N₁-hCacyBP对照组，及S3A，S34A，S48A，S137A，S141A，S142A，S180A，S188A，S217A这9组突变体分别转染入SW480细胞内，发现：pEGFP-N₁定位于细胞核；pEGFP-N₁-hCacyBP对照组hCacyBP蛋白在细胞浆中表达；S180A突变体在SW480细胞中绿色荧光分布于细胞核，并与蓝色荧光重合，说明hCacyBP蛋白的第180位丝氨酸突变失活后，hCacyBP蛋白能进入细胞核，出现核转位现象，因此，hCacyB的180位丝氨酸磷酸化对其核转位没有影响；S3A，S137A，S141A，S217A这4组突变体，绿色荧光很弱，分布于细胞膜上；S34A，S48A，S142A，S188A这4组突变体，绿色荧光较弱，只在细胞浆中表达，未与蓝色荧光重合，说明这4个丝氨酸磷酸化位点有可能会影响结肠癌中hCacyBP的核转位。结论： hCacyBP的第180位丝氨酸磷酸化位点不是引起结肠癌细胞中hCacyBP核转位的磷酸化位点。第3位、34位、48位、137位、141位、142位、188位、217位丝氨酸磷酸化位点可能是引起hCacyBP核转位的重要靶点。