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一、基础实验部分目的:了解CD3AK(anti-CD3 monoclonal antibody activated killer cells, CD3AK)细胞的诱导方法及免疫生物学特性,进一步探明其 抗肿瘤作用机理。方法:采用抗CD3单克隆抗体(anti-CD3 monoclonal antibody,CD3McAb)和重组白细胞介素2(recombinant interleukine-2,rIL-2)等共刺激人外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells,PBMC)诱导CD3AK 细胞,用碱性磷酸酶桥联免疫酶标法(APAAP法)分析CD3AK 细胞的表型,四唑盐比色试验(MTT法)检测其对K562细胞的最 适宜效靶比,并观察杀瘤活性动态变化及对K562、A2780、H7402 瘤细胞株的细胞毒活性比较。酶联免疫法检测CD3AK与A2780、 H7402共育前后肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ的动 态变化,在透射电镜下观察A2780、H7402凋亡的形态学变化。结果:1、CD3AK细胞增殖动力学观察结果: CD3McAb和rIL-2共刺激诱导的CD3AK和单纯rIL-2诱导的LAK 细胞在培养的前4天扩增倍数相接近(P>0.05),但以后随着 时间和CD3McAb剂量的递增,CD3AK细胞的扩增倍数远大于LAK 细胞(P<0.01)。CD3AK细胞至少维持16天的增长趋势。2、CD3AK、LAK细胞表型分析结果: CD3AK细胞是以CD3+、CD4+、CD8+细胞为主的异质性细胞群,其 中CD3+、CD4+、CD8+均显著高于LAK细胞(P<0.01)。 3、CD3AK细胞对K;;;细胞株杀伤作用的最适宜浓度 ③3北细胞与靶细胞以10:1的效靶比共育时,其杀瘤活性显著 低于20:1和40卜而20*和40J两组无明显差异,提示CD3AK 细胞对K;。;细胞最适宜的效靶比为20:l。 4、CD3AK细胞的杀瘤活性动态变化观察结果: CD3AK细胞与K;;;细胞共育结果发现,在培养至第4天的CD3AK 细胞即有较高的杀瘤活性,至第10天时达高峰。 5、CD3AK、LAK、NK细胞的杀瘤活性*较结果: CD3AK细胞对 K;;;、H;。。;细胞的杀伤活性显著高于 LAK、NK细胞吓 <O.叮),但对人;;。细胞株的杀伤活性与*K、瞅细胞较接近吓 >0.05)。 6、CD3AK、LAK与AnM、H川叮共育上清细胞因子TNF-a、IFN-Y 分泌水平检测结果: CD3AK、LAK细胞分另与 A;;;。、H;4;;以 2 0:1、4 0:1的效靶比共育 2 4 h,结果表明作用前后 TNF-a、IFN-Y分泌水平具有显著 性差异p<0.01厂 共育后H者的分泌水平显著高于共育前。 LAK、CD3AK两组的TNF-a分泌水平达到高峰的时间分别为共 育后sh、12h,而两组IFN-Y分泌水平于作用后sh达到分泌 高峰。 7、CD3AK细胞诱导A;;;。、H,;。;细胞凋亡的形态学观察结果: CD3AK细胞分别与A;;;。、H;;。;共育24小时后,在透射电镜下可见 肿瘤细胞呈典型的凋亡形态学特征:胞核固缩,染色质沿核膜下 呈星月状聚积,胞膜肿胀起泡,可见凋亡小体。 结论CD3AK细胞易于诱导扩增、细胞毒性强,存活时间长,是一种 优于LAK细胞的新型抗肿瘤免疫效应细胞。