马铃薯Y病毒NIa蛋白酶基因介导的抗病性研究

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为了制备PVY-C NIa的抗血清,首先构建了6kD-NIa和VPg基因片段的原核表达载体。酶切和PCR扩增得到PVY-C 6kD-NIa和VPg基因片段,分别克隆到表达载体pET-28a中,酶切鉴定、PCR扩增和序列测定结果证明目的基因正确插入到了载体pET-28a中,而且含有正确的阅读框架。经IPTG诱导后,分别表达了分子量约为27kDa和25kDa的蛋白。纯化了的VPg蛋白免疫兔子后,得到效价为1:3000的抗血清。Westernblot分析表明VPg抗血清能够与感染了PVY-C植物中的NIa蛋白发生特异免疫反应,成功地获得了特异性VPg多克隆抗体。 对转PVY-C 6kD-NIa基因烟草T2代和T3代进行抗病性试验,攻毒结果分三种类型:全部表现为抗病和恢复;抗性丧失,全部表现为感病;抗病、恢复和感病三种表现型,发生了性状分离。T2代和T3代中均有全部抗性的株系,表明PVY-C 6kD-NIa介导的抗病性能够遗传到T3代。 对T2代和T3代转基因烟草PCR检测和Southern blot结果表明PVY-C 6kD-NIa基因不仅整合到烟草染色体中,存在于T3代转基因烟草中。利用VPg多克隆抗体,对T3代转基因烟草进行了Western blot分析。结果表明,PVY-C 6kD-NIa基因在转基因烟草T3代植株中得到了表达,而且抗病、恢复和感病的转基因植株中均有表达。对转基因蛋白表达产物的定量分析表明抗病、感病、恢复植株转基因蛋白的表达量分别占可溶性总蛋白的0.144%、0.086-0.096%、0.110-0.134%。其中,抗性植株高于恢复植株,感病植株最低。这表明,转PVY-C 6kD-NIa基因烟草的病毒抗性与外源基因蛋白的表达有关。 对接种后38天的转基因植株进行了蛋白定量分析。结果表明,转基因植物中抗性和恢复植株的表达量比接种前明显降低,甚至检测不到,感病植株的蛋白含量反而提高。关于接种PVY-C后,转基因蛋白表达量显著降低的原因尚待进一步研究。
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