研究背景与目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)。目前研究认为发病与基因、肠道菌群、环境因素有关。IBD在西方及北欧的发病率较高,近年我国的发病率呈现逐年增高的趋势。目前关于IBD的研究主要集中在诊断和治疗上,对其分子机制尚缺乏系统研究。一般情况下UC和CD可以根据临床、内镜、病理综合分析判断。但是如果结肠广泛病变,并且内镜、病理表现不典型时,UC和CD有时难以鉴别；如果IBD内镜下炎症表现较轻,无典型内镜下改变,还需要与肠道感染性疾病相鉴别。CD、肠结核(intestinal tuberculosis, ITB)、肠道淋巴瘤(intestinal lymphoma,IL)因为存在诸多相似的地方,三者之间的鉴别也是临床的一个难题。ITB多由活动期肺结核病人吞下含结核杆菌的痰,结核杆菌穿透肠黏膜定植在肠道引起。原发性胃肠淋巴瘤(primary gastrointestinal lymphoma, PGL)是非霍奇金氏淋巴瘤中具有特征性并所占比例较少(11%-34%)的一类,在原发性胃肠淋巴瘤中,IL约占15%-20%。目前病因未明。ITB和IL近年来在发达国家和发展中国家都有上升趋势。CD、ITB、IL临床表现(如腹痛、腹泻)缺乏特异性,内窥镜下多累及回盲部、手术及病理有很多相似之处,如肠壁的慢性非特异性炎症、肉芽肿、溃疡和节段性病变等。而治疗方案却有巨大差异性。所以误诊会带来严重的后果。这几种疾病的鉴别对临床医生来说是一项重大挑战。目前,临床上尚未有简单易行的实验室方法来鉴别诊断IBD。血液学指标如白细胞计数、血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)和C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)均无特异性。诊断ITB最可靠的是从肠道组织中发现结核杆菌,但是抗酸染色特异性、敏感性都不够。分枝杆菌的培养要耗时,而结果通常是阴性的(25%-35%)。PPD皮试阳性作为ITB的诊断并不可靠。诊断性抗结核治疗时间长,会对病人健康产生影响。而活检取材多浅小,只能取到黏膜层和部分黏膜下层,并不能观察肠壁全貌,病理黏膜非特异性炎症的检出率常较高,因此一些特征性的病变难以被发现,如属于全壁性炎症的CD的特异性病理表现非干酪样坏死,IL的淋巴瘤细胞以黏膜下浸润为主,而隐窝脓肿不仅见于UC,也见于CD和ITB。所以IL常常需要手术切除后行免疫组化才能最后确诊。最近关于ITB诊断的研究进展还包括对ITB粘膜活检组织进行“DNA原位PCR”技术。PCR检测的速度快,准确性高,与组织中是否有干酪样坏死性肉芽肿无关,但敏感度低,且受组织样本大小以及样品和甲醛接触时间的影响。Wolfgang Tillinger最近证明血清血指标CD64可以用来鉴别IBD、感染性肠炎及功能性胃肠病。近来有人在IBD患者粪便中发现钙卫蛋白升高,但后来发现,感染性肠炎中也存在,诊断特异性不高。抗酵母菌抗体(antisaccharomyces antibodies, ASCA)和抗中性粒细胞胞浆抗体(perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibody, pANCA)对鉴别CD敏感度较高,但特异性低。ASCA无法鉴别CD和ITB。最近有研究发现,ASCA和pANCA对中国和日本人的敏感性较低。另有学者认为从CD患者组织提取物中测定特异性的RAN序列,对临床诊断的CD活检组织进行检测,发现阳性率80%,其作为组织学标记物的潜在应用价值值得进一步研究。综上所述,目前仍无一种简单易行的可以鉴别IBD的金标准。它们的鉴别需要从临床、影像学、内镜、病理学表现等多方面综合考虑。近几年出现的一些新的检查方法虽很有前途,但尚需更多的临床试验进行验证。我们课题组运用蛋白质组学技术,筛选出UC与正常人肠道黏膜差异蛋白若干,其中包括活化的cdc42结合蛋白激酶1(activited Cdc42 kinase1, Ack1)和Mawb结合蛋白(Mawb binding protein, Mawbp)。Ackl体内发挥的作用及其具体机制尚不十分清楚。目前仅有少量研究认为它参与细胞生长、抑制细胞凋亡,促进血管生成、细胞浸润和转移,在晚期肿瘤的转移中发挥作用。因为它与胞内外信号通路核心蛋白Cdc42结合,参与和炎症及肿瘤均相关的MAPK、NF-kB等信号通路,于是我们推测它在细胞内可能发挥重要作用。目前关于Mawbp的文献仅有3篇,Zhang J通过比较原发型胃癌与周围黏膜蛋白表达的差异,认为Mawbp是胃癌相关蛋白。WesthoffTH研究发现Mawbp在低血压大鼠血液中高表达,推测其有调节血压的功能。Kurokawa分析肝癌组织与癌旁组织的基因差异表达发现Mawbp在肝癌中高表达,因此他推测Mawbp在肝癌形成中可能发挥重要的作用。目前国内外尚未见Ackl和Mawbp与IBD相关文献报道。我们课题组的前期工作证明Ack1和Mawbp在UC肠道黏膜较正常人肠道黏膜含量差异明显。这几个蛋白的改变是UC特有还是炎症的普遍改变,目前尚不清楚。又如前文所示,Ack1和Mawbp与某些消化系统肿瘤相关,那么我们推想Ack1可能参与UC的癌变。UC癌变不同于普通的散发性结肠癌。UC相关性结肠癌常发生于平坦型不典型增生或有不典型增生的病灶(dysplasia-assoeiated lesiono mass, DALM),而散发性大肠癌多由散发性腺瘤性息肉(sporadic adenoma, SA)发展而来,按照腺瘤-不典型增生-大肠癌-转移的途径发生。它们的分子机制有诸多不同,如p53突变为UC癌变的早期事件,APC突变及其失活导致的Wnt途径激活在结直肠癌发生初期具有重要作用,但在IBD相关结直肠癌正好相反。UC-associated SAs和non-UC-associated SAs的p53、APC表达与DALM相反。从分子水平上证明DALM与SAs的区别。Ack1、Mawbp在这几种组织结构中的表达是否有差异性,它们能否作为UC癌变区别于普通大肠癌的标志物,目前不清楚。因此,本次实验的目的是希望通过对IBD、ITB、IL、普通肠道炎症及息肉、DALM中进行Ack1、Mawbp分子标志的系统检测,观察相对完整的Ackl1、Mawbp在这几种疾病中的表达情况,从而推测：(a)它们是否能将IBD病人与ITB、IL、感染性结肠炎、慢性结肠炎相鉴别；(b)它们是否与炎症相关；(c)它们能否鉴别non-UC-associated SAs、UC-associated SAs、DALMs以及炎性息肉。以期找出IBD发生发展的分子学基础及其与传统的大肠腺瘤-癌变途径的差异。材料和方法1.完全随机收集78例UC、27例CD、20例感染性肠炎、26例慢性结肠炎、60例肠道黏膜正常病人、15例ITB、6例IL、6例UC-associated SAs、4例DALMs、10例non-UC-associated SAs、10例UC相关性炎症性息肉、10例散发性炎症性息肉；2.比较UC组和CD组之间临床病理学资料的差异,包括患者性别、年龄、病变累及部位、白细胞、血小板、血沉、C反应蛋白等；3.运用免疫组织化学染色技术观察Ack1、Mawbp在上述各组中的表达情况；4.统计分析：采用SPSS 13.0统计软件进行分析,用Independent-Samples T Test测定组和组之间患者年龄的差异;用One way ANOVA测定多组计量资料之间的差异性；用Chi-square tes、Mann-Whitney U test测定两组之间其他因素的差异(包括性别、血清学指标及各个分子的染色情况等)；用Kruskal Wallist测定多组等级资料之间的差异；用Spearman rank-order correlation coefficient测定各等级资料之间或者等级资料与计量资料之间的相关性。所有分析结果取双侧P值,P<0.05认为差异具有显著性。结果1.78例UC有33例发生于直肠(43.4%),23例发生于左半结肠(30.3%)。25例CD有20例发生于小肠及回末(74.1%)。2.CD病人的CRP显著高于UC组(10.95vs1.8,P<0.05)和正常对照组(10.95vs5,P<0.05)。临床活动度为中重度的UC病人的CRP高于正常人(6.4vs5,P<0.05)和临床活动度为轻度的UC患者(2.14±1.44),PLT、ESR、APTT、PT、CEA、CA199指标CD和UC之间,IBD与正常人之间无显著差异(P>0.05)；两组在性别、年龄等方面无显著差异(P>0.05)。不论是在UC组(r=0.604,P<0.05)还是在CD组(r=0.652,P<0.05),CRP均与ESR呈正相关关系,且相关关系密切。UC组临床分级与CRP呈正相关且关系密切(r=0.563,P<0.05),而与ESR呈正相关但关系不密切(r=-0.409,P<0.05)。CD组中临床分级与CRP、ESR无关(P>0.05)。3.在CD和UC组,Ack1的表达与临床活动度呈正相关性(r=0.693,P<0.05)；在UC组,Ack1胞浆表达与Mawbp的胞浆表达具有负相关性(r=-0.503,P<0.05)；在CD组,Mawbp与CEA的胞浆表达呈负相关性(r=-0.607,P<0.05),Ack1的胞浆表达与Mawbp的胞浆表达无关(P>0.05)。4.感染性肠炎中Mawbp表达与炎症病理分级呈正相关(P<0.01),但相关关系均不密切(r<0.5)。Ack1表达与慢性结肠炎、感染性肠炎炎症病理分级无关(P>0.05)。CD和UC组Ack1和Mawbp的胞浆表达与病理分级无关(P>0.05)。5.以正常人为对照组,在UC组Ack1+的敏感性(88.9%)和符合率(84.06%)较高,特异性(78.8%)较低；而在CD组,Ack1+的特异性(90%)和符合率(83.33%)较高,敏感性(66.6%)较低。以正常组+慢性结肠炎+感染性肠炎为对照组,在UC组Ack1+的敏感性(65.31%)和特异性(83.70%)较高,符合率(73.91%)稍低；而在CD组,Ack1+的特异性(92.30%)较高,敏感性(32.00%)和符合率(68.75%)较低。6.Ack1在本组所有ITB(15/15)和IL(6/6)中均高表达(3+),Mawbp表达量中等(2+)。ITB和IL表达无显著性差异(P>0.05)。7.Ack1在SAs(2+或3+)中表达明显高于炎性息肉(-或+)。相同程度不典型增生的DALM和UC-associated-SAs或non-UC-associated-SAs染色无显著性差别(P>0.05)。结论Ack1、Mawbp在IBD、ITB、IL、感染性肠炎、慢性结肠炎中均有表达,广泛参与炎症反应,与炎症具体关系复杂,不是IBD特异性标志物。Ack1不是UC癌变有别于普通大肠癌的特异性指标,可能通过促生长和抗凋亡在结肠癌的发展过程中发挥作用,应只是推动作用而不是起始因子的作用。