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有机致癌物自身通常缺乏生物反应性,需要经过代谢活化才具有致突变和致癌性。化学物的致突变性筛查通常采用体外细胞遗传毒理学试验,然而,由于常规细胞缺少生物转化酶活性,易致假阴性结果。采用体外代谢活化系统(如大鼠肝脏S9混合物)可增加致突变物的检出率。然而,某些重要的代谢酶在肝细胞中并不表达或者表达量不受常用诱导剂(如Aroclor 1254)影响,导致依赖相应酶活化的前致突变物在添加S9混合物的实验体系中也表现为阴性结果。采用重组表达特定细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)酶的细胞系作为遗传毒性研究的实验体系可明显增加前致突变物的检出率。CYP2E1是活化某些亲脂性小分子化合物的重要代谢酶,表达该酶的各种细胞模型已被用于研究相关前致突变物的遗传毒作用,然而关于细胞内表达代谢酶的实验体系与细胞外添加S9混合物的活化体系的比较优势尚未见报道。N-二乙基亚硝胺(NDEA)是重要的食品污染物及肝脏诱癌剂,在缺乏代谢酶活性的实验体系中遗传毒性试验结果为阴性,只有在添加S9混合物并采用高浓度处理才表现致突变作用。有研究提示其可能经CYP2E1酶代谢活化。本研究采用表达人CYP2E1酶的重组中国仓鼠(V79)细胞和人肝(L-02)细胞研究NDEA的遗传毒性及其对CYP2E1酶的依赖性,并将其与在S9混合物作用下对缺乏代谢活性的V79-Mz(无CYP酶表达)细胞的效应进行比较,以探讨细胞内酶表达体系用于体外遗传毒性研究的优势。由于CYP2E1的底物一般为有机物,试验中需要有机溶剂助溶。然而,据报道常用的有机溶剂二甲基亚砜(DMSO)可抑制CYPs酶活性,其中以对CYP2E1酶的作用最强;而其他许多有机溶剂(如甲醇、氯仿、丙酮等)不巧却均为CYP2E1底物,不适合作为相关遗传毒性试验的受试物助溶剂。DMSO是否会影响前致癌物经人CYP2E1活化产生的遗传毒作用迄今无报道,考虑到DMSO浓度对相关实验模型可能构成重要的影响,本研究选择NDEA(可兼溶于水和有机相)作为模型前致突变物探讨DMSO对人CYP2E1依赖性遗传毒作用的影响,为优化CYP2E1酶依赖性遗传毒性实验模型的实验条件提供可靠依据。多氯联苯是具有致癌效应的持久性有机污染物,但其代谢活化酶和致突变效应一直未明确。本课题组报道了一氯联苯和二氯联苯经CYP2E1活化后可对哺乳动物细胞诱发微核和基因突变作用。空气和人体样本检测结果显示,某些三氯、四氯联苯的暴露水平比一氯、二氯联苯更高,具有更大的潜在健康风险,但遗传毒理学试验数据缺乏。本研究还将使用已优化的CYP2E1酶依赖性遗传毒性实验体系探讨三氯联苯、四氯联苯化合物经人类CYP2E1酶代谢活化导致基因突变作用及突变类型,并探讨PCBs在联苯骨架上氯取代基增加对遗传毒性强度的影响。目的1.探明NDEA经CYP2E1酶代谢活化在哺乳动物细胞中导致的遗传毒作用及细胞内CYP2E1酶活化实验体系相对于S9混合物体系的优势,并评价DMSO作为溶剂应用于相关遗传毒性试验的适用性,提出不干扰试验结果的DMSO浓度限值,以优化CYP2E1酶依赖性遗传毒性试验的条件。2.探讨非共平面(非二恶英样)三氯联苯和四氯联苯化合物(PCB 22、PCB 28、PCB 52、PCB 74)对重组表达人CYP2E1的哺乳动物细胞诱发Hprt基因突变作用,并了解受试物诱发突变子的Hprt基因序列改变特征。方法1.受试细胞系:V79-Mz,表达人CYP2E1酶的重组V79细胞系(V79-hCYP2E1),以后者为母体细胞构建的同时表达人硫酸基转移酶(SULT)1A1的重组V79细胞系(V79-hCYP2E1-hSULT1A1),以及人肝细胞(L-02)系。2.受试化合物:NDEA、2,3,4’-三氯联苯(PCB22)、2,4,4’-三氯联苯(PCB 28)、2,2’,5,5’-四氯联苯(PCB 52)和2,4,4’,5-四氯联苯(PCB 74)。3.试验方法:采用CCK-8试验分析细胞毒作用,用微核试验、Hprt致突变试验测试遗传毒作用;免疫印迹(Western Blot)试验和实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测CYP2E1蛋白和mRNA水平;采用基因测序技术分析突变细胞Hprt基因碱基序列改变。结果1.CYP2E1酶依赖性遗传毒性实验模型探讨(1)NDEA依赖人CYP2E1酶的致突变作用及其在不同实验体系中遗传毒性强度的比较①NDEA对V79-Mz细胞无诱发微核或致突变作用,然而它对V79-hCYPE1-hSULT1A1和L-02细胞可诱发微核和/或/Hprt突变,且该作用可被CYP酶抑制剂或CYP2E1专一抑制剂所阻断。②NDEA对V79-hCYPE1-hSULT1A1细胞诱发微核作用的强度和效能显著高于其对添加S9混合物的V79-Mz细胞的效应。(2)CYP2E1酶依赖性遗传毒性实验条件的优化—溶剂DMSO工作浓度探讨①DMSO在0.05%～0.2%(v:v)浓度范围内不影响NDEA对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱发微核和基因突变作用;DMSO在0.1%和0.2%浓度即分别明显降低NDEA对L-02诱发微核和对V79-hCYP2E1细胞(CYP2E1蛋白水平均远低于V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞)致突变作用。②DMSO在0.05%～0.2%浓度范围不影响V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞CYP2E1蛋白水平,并且对上述细胞以及V79-hCYP2E1和L-02细胞CYP2E1的mRNA水平也无影响。2.几个三氯联苯、四氯联苯化合物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞的致突变作用(1)受试PCBs(PCB22、PCB28、PCB52、PCB74)对V79-Mz细胞无致突变作用,对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞(五氯酚同时暴露以抑制SULU1A1)均诱发Hprt基因突变,且有浓度相关性。(2)从PCB 74(四氯联苯)致突变作用的强度和效能均明显高于PCB 28(三氯联苯,化学结构与前者高度相似)来看,氯化程度的增高未必导致致突变性减弱,甚至可增强。(3)以PCB 28和PCB 52诱发的突变子为代表,基因测序结果提示Hprt基因突变以碱基置换及外显子缺失为主要特征;阳性对照NDEA诱发的突变的主要类型为碱基置换,A:T-→G:C出现频率最高。结论1.表达人CYP2E1的重组细胞比人肝L-02细胞及V79-Mz(添加S9混合物)具有更好的代谢活化效果,是更适用于研究CYP2E1依赖性前致突变物的实验模型;该实验体系中作为受试物溶剂的DMSO在0.05%至0.2%浓度范围一般不影响试验结果,尤其是当CYP2E1蛋白量相对充足时。2.非二恶英样化合物PCB 22、PCB 28、PCB 52、PCB 74具有依赖人CYP2E1酶的致突变作用,而氯化程度增加有时会增强致突变效应(PCB 22、PCB 52、PCB 74分别强于结构相似的PCB 5、PCB 9、PCB 28);PCBs和阳性对照物NDEA诱发的突变类型包括单碱基置换、外显子缺失等,表现出以单碱基置换为主的特征。